Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
8. (Фриденштейн А. Я-, Чайлахян P. К., Лациник H. В. и др.) Fridenshtein A. Ja., Chailachan R. K-, Latsinik N. V. et al. Stromal mechanocytes responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and
* retransplantation in vivo // Transplantation. 1974. Vol. 17. P. 331—340.
9. Лурия E. А., Оуэн М., Фриденштейн А. Я., Кузнецов С. А., Генкина Е. Н., Го-стева В. В. Образование кости в органных культурах костного мозга // Бюл. экспе-рим. биологии и медицины. 1986. Т. 101. С. 481—484.
10. Лурия Е. А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах. М., 1972. 176 с.
11. (Фриденштейн А. Я-, Лациник Н. В., Грошева А. Г., Горская Ю. Ф.) Fridenshtein A. Ja., Latsinik N. V., Grosheva A. G., Gorskaya Ju. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous, sponges//Exp. Hematol. 1982. Vol. 10. P. 217—227.
12. Reynolds J. J. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in electron microscopy//J. Cell Biol. 1963. Vol. 17. P. 208—212.
13. Fell H. B., Mellanby E. The effect of hypervitaminosis A on embryonic limb-bones cultivated in vitro//J. Physiol. 1952. Vol. 116. P. 320—329.
Культивирование скелетно-мышечных клеток
Т. А. Крылова, И. И. Фридлянская
Институт цитологии АН СССР, Ленинград
Клетки диссоциированной скелетной мышцы, введенные в культуру, претерпевают ряд превращений, сходных с развитием скелетной мышцы в онтогенезе. Процесс начинается с прикрепления недифференцированных одноядерных скелетно-мышечных клеток (миобластов) к субстрату. Такие клетки делятся и при достижении высокой плотности в культуре начинают сливаться с образованием многоядерных миотуб, в которых синтезируются специфические сократительные белки, формируется организованный миофибрилляр-ный аппарат, происходит изменение изозимного спектра ферментов энергетического обмена, увеличение активности ацетилхолинэсте-разы и холинорецепторов на мембране. Зрелые миотубы способны к ритмическому сокращению.
Таким образом, миогенные клетки, культивируемые in vitro, формируют высокодифференцированные структуры, которые морфологически, биохимически и функционально сходны с мышечными волокнами. Благодаря этому они широко используются для изучения закономерностей миогенеза (см. обзор: [1]).
Нормальные скелетно-мышечные клетки дифференцируются только в первичных культурах. При пересевах они могут сохранять пролиферативные потенции, но способность образовывать зрелые скелетно-мышечные структуры (миотубы) утрачивается. Поэтому были предприняты попытки получить постоянные культуры дифференцирующихся скелетно-мышечных клеток (см. обзор: [2]).
Наибольшее распространение в исследованиях закономерностей миогенеза получили крысиные клеточные линии Ьб, Le [3]. Они были получены из бедренной мышцы новорожденных крыс. Хотя процедура получения подробно описана [4], воспроизвести ее довольно трудно. Это объясняется, по-видимому, как индивидуальными особенностями животных-доноров, так и относительной стандартностью условий культивирования. Клеточные линии Ьб, Le и некоторые другие дифференцируются с образование миотуб, причем в основном этот процесс протекает сходно с миогенезом в первичных культурах. Преимуществом постоянных клеточных линий является их однородность (в первичных культурах стартовой точкой каждый раз является новое животное-донор), а также возможность различных генетических манипуляций.
Следует, однако, подчеркнуть, что постоянные клеточные линии способны к неограниченному размножению in vitro и, следовательно, трансформированы. Дифференцирующиеся миогенные клеточные линии являются минимально трансформированными, поскольку по многим признакам они сохраняют сходство с нормальными клетками (нетуморогенны, не растут в мягком агаре и др.).
Источники миогенных клеток
Источниками миогенных клеток могут служить разнообразные животные: птицы, млекопитающие, насекомые. Но чаще работают на миогенных клетках птиц и млекопитающих.
Скелетные мышцы птиц. В качестве исходного материала для получения первичной культуры из скелетных мышц птиц берут бедренную мышцу задних конечностей и грудную мышцу 10—12-суточных эмбрионов (обычно кур и перепелок). Именно в эти сроки удается получить наибольший выход одноядерных миобластов, образующих многоядерные миотубы при последующем развитии. Число миобластов несколько выше в бедренной мышце, чем в грудной того же возраста [5]. С эмбрионами, взятыми в более ранние сроки, трудно работать из-за их небольшого размера. В более поздние сроки пул предшественников миобластов уменьшается, преобладают многоядерные миотубы.
1. Бедренная мышца (работают с жизнеспособными, хорошо
развитыми эмбрионами): 1) перед работой яйца тщательно протереть 70 %-ным этанолом; 2) тупым концом пинцета разбить поверхность яйца так, чтобы не повредить белую оболочку; 3) стерильным пинцетом удалить белую оболочку, при этом обнажается вителлиновая оболочка со множеством кровеносных сосудов; 4) осторожно погрузить пинцет внутрь вителлиновой оболочки, достать эмбрион и перенести его в стерильную чашку Петри (для накопления эмбрионов процедуру извлечения повторить); 5) вырезать бедро с помощью стерильных инструментов, удалить кожу, хрящи. Все операции следует делать так, чтобы не повредить нежную ткань куриного эмбриона.
