Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
2. Грудная мышца: 1) повторитдроцедуру 1 (1—4); 2) удалить конечности, обезглавить куриный эмбрйон; 3) снять кожу, удалить внутренние органы; 4) отсечь грудную мьгцшу, отделить прилегающую соединительную ткань; грудную мышцуХоместить в стерильную чашку Петри.
Скелетные мышцы млекопитающих. Культуры скелетных мышц млекопитающих (обычно крыс или мышей) могут быть приготовлены из задних конечностей эмбриональных или неонатальных животных; оптимальный возраст — сутки после рождения. У более взрослых животных пропорция одноядерных клеток быстро снижается в результате слияния их в многоядерные миотубы. Считают, что наиболее высокий выход миобластов дают крысы Wistar.
Крысиные мышечные клетки обладают некоторым преимуществом перед куриными миобластами: процесс формирования мышечного волокна более синхронный.
Подготовка материала: 1) смещением шейных позвонков убить животное; зафиксировать на парафиновой пластинке; 2) промыть тушку 70 %-ным этанолом; 3) снять кожу с задних конечностей, отделить скелетную мышцу с помощью стерильных инструментов;
4) прополоскать выделенную мышцу 2—3 раза в растворе фосфатного буфера (PBS) с антибиотиками (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина); 5) удалить из мышцы хрящи и кости; измельчить до частиц величиной 2—3 мм.
Дезагрегация ткани
Кусочки мышечной ткани могут быть диссоциированы с помощью ферментов или механическим способом. При механическом способе получения клеточных суспензий клетки повреждаются меньше, чем при использовании ферментов. Однако выход клеток, полученных механическим путем, ниже. Механическую диссоциацию применяют главным образом для куриных и перепелиных эмбрионов. Ферментативную дезагрегацию используют для млекопитающих.
Механическая дезагрегация: 1) выделенные грудные или бедренные мышцы поместить в стерильную колбу с магнитом; 2) в колбу налить 10-кратный объем раствора PBS (по отношению.к осадку);
3) поставить колбу на магнитную мешалку на 15—20 мин при комнатной температуре; 4) слить надосадочную жидкость, добавить но-
вую порцию буфера PBS (дробную дезагрегацию можно проводить до полной диссоциации ткани); 5) суспензию клеток профильтровать через капрон; 6) суспензию одиночных клеток центрифугировать при 700 g 5 мин; 7) осадок промыть раствором PBS 1—2 раза, надоса-дочную жидкость слить; 8) добавить небольшой объем питательной среды, подсчитать концентрацию клеток в камере Горяева; 9) клетки суспензировать в полной ростовой среде; на чашку диаметром 50— 60 мм посеять 5 мл клеточной суспензии в концентрации (4—(6)Х X Ю5 клеток/мл.
Ферментативная дезагрегация. Для дезагрегации кусочков мышечной ткани чаще всего используют раствор трипсина (0.05— 0.25 %-ный) или раствор коллагеназы (0.05—0.1 %-ный). Иногда используют смесь равных объемов раствора трипсина (0.25 %) и версена (0.02%).
Дезагрегация: 1) измельченную ткань поместить в стерильную колбу с магнитом; 2) в колбу налить раствор трипсина или коллагеназы; 3) поставить колбу на магнитную жешалку на 5 мин, слить и отбросить суспензию клеток; 4) добавить новую порцию фермента, диссоциировать 15 мин, тедиссоциированным фрагментам дать осесть, суспензию слить; 5^) профильтровать суспензию клеток через капроновый фильтр, предварительно фильтр смочить растворгота PBS (2—3 мл), добавить сыворотку до конечной концентрации 10 % (для ингибирования трипсина), процедуры 4—5 можно повторить; 6) центрифугировать суспелзию при 700 gS мин; 7) осадок промыть раствором PBS 1—2 раза; $) суспензировать осадок в небольшом количестве среды, подсчитать в камере Горяева концентрацию клеток; 9) добавить полную ростовую среду, клетки рассеять в 5 мл среды в чашки Петри диаметром 50—60 мм с конценщрацией клеток (4—6)- 105 клеток/мл.
Среда для культивирования
Стандартная ростовая среда включает в себя смесь питательной среды постоянного состава (синтетическая среда) и сыворотки. Среди синтетических сред чаще применяются среда Игла, минимальная среда Игла (МЁМ;), (.феда Игла >в модификации Дальбекко (ДМЕ), среды F-10, F- Г2 и L-15.
Используют следующие виды сыворотки: коровью (эмбриональную, постнатальную), лошадиную, человеческую плацентарную. Концентрация сыворотки ва,р.шрует от 0.5 до 15 %. Сыворотка играет большую роль в прикреплении, пролиферации и дифференцировке миобластов. Многие авторы отдают предпочтение лошадиной сыворотке, однако удовлетворительные результаты при получении дифференцирующихся миобластов получены и с эмбриональной сывороткой коров. Партии сывороток варьируют, поэтому при работе с миогенными дифференцирующимися клетками требуется тщательный отбор партий, которые эффективно влияют на миогенез,.
Кроме синтетической среды и сыворштии в состав питательной среды могут входить другие компоненты, влияющие на рост ж диф-
кислоте центрифугировать-. И—2 ч, 2000 g при 4 °С; 8) супернатант (раствор коллагена) снова центрифутфоаяшь. при 3000 g 1—2 ч при 4 °С; 9) раствор коллагена разлить г№ 1—2 мл и хранить при — 10 °С или ниже.
Обработка поверхности культуральных сосудов раствором коллагена: 1)' на ташку Петри диаметром 60 мм нанести 0:5 мл коллагена и 0.1 мл 6 %-н.ога раствора* №14С1; 2) смешать вместе и распределить по поверхности чашки ГБат.ри;- 3) добавить 3 мл стерильной дистиллированной воды на 1—2 мин (для удаления'соли);
