Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Через 6 и более месяцев культивирования может наступить
4-я фаза. В некоторых культурах количество неадгезивных клеток резко увеличивается (до 1 • 10 клеток/мл), они быстро пролиферируют и могут вызывать развитие опухолей у животных. Иммуноглобулины, синтезируемые в 4-й фазе, существенно менее гетерогенны и часто являются моноклональными.
В описанных культурах присутствие адгезивной подложки необходимо для пролиферации и дифференцировки В-лимфоцитов. Адгезивный слой длительно сохраняется неизменным, однако через 14—
16 нед часто теряет способность к поддержанию В-лимфоцитов. Продлить лимфопоэз можно, если перенести лимфоциты на свежий адгезивный слой; клетки костного мозга для его выращивания экс-плантируют с меньшей исходной плотностью— (0.75—1) • 105 клеток иа 1 см2 поверхности сосуда. Полученные таким способом культуры к концу 3-й недели конфлюэнтны на 30—50 %, свободны от собственных лимфоидных клеток и пригодны для добавления В-лимфоцитов. Последние (в 1—2 мл среды) извлекают из исходной культуры, осторожно пипетируют и добавляют в кондиционированную среду поверх свежего адгезивного слоя. Плотность клеток в новых культурах достигает исходных значений за 2—3 нед при первом переносе и за 4—7 сут при более поздних переносах [31J. В случае переноса плавающих клеток в сосуд, лишенный адгезивной подложки, лимфоциты прекращают пролиферацию и гибнут в течение нескольких суток [33]. Адгезивный слой можно неоднократно пассировать (при помощи коллагеназы) с сохранением способности к поддержанию лимфопоэза [31]. Наконец, лимфоциты, выделенные из культур, могут быть клонированы методом лимитирующих разведений в колодцах с предварительно выращенной адгезивной подложкой. Полученные клональные линии пре-В- и В-клеток синтезируют один вид тяжелых цепей и (в случае В-клонов) один вид легких цепей иммуноглобулинов [31, 34].
Адгезивные слои костномозговых клеток способны поддерживать пролиферацию и дифференцировку эмбриональных В-лимфоцитов. Суспензию клеток печени 14—17-суточных мышиных эмбрионов приготовляют описанным выше методом и в концентрации 1 • 106 клеток/мл наслаивают на заранее выращенный адгезнвный слой костномозгового происхождения. Через 3—4 сут добавляют порцию свежей среды, через 7 сут переносят все неадгезивные клетки на новую костномозговую подложку; дальнейшее культивирование ведут по стандартной схеме. Существенно, что адгезивный слой, установлен- v ный клетками самой эмбриональной печени, неспособен поддерживать длительный рост лимфоидных клеток. Более того, необходимость переноса на свежую подложку, по-видимому, означает, что адгезивные клетки эмбриональной печени ингибируют лимфопоэз. Как и в культурах костного мозга, в культурах эмбриональной печени количество пре-В-лимфоцитов начинает расти после 4—6-й недели культивирования. Напротив, клетки, несущие поверхностные иммуноглобулины, на всех стадиях весьма малочисленны. Следовательно, в культурах эмбриональной печени преобладают лимфоциты, находящиеся на более раиней стадии В-клеточиой дифференцировки, чем
в культурах костного мозга; такие незрелые лимфоциты могут сохраняться in vitro в течение 3 мес и дольше [32].
Рассмотренная система культивирования позволяет получать очищенные (в том числе клональные) В-клеточные популяции. Она весьма перспективна для анализа ряда вопросов клеточной иммунологии, в частности ранних этапов В-лимфоцитарной дифференци-ровки, развития В-лимфоцитов в отсутствие Т-клеточных влияний, молекулярных процессов, вовлеченных в созревание В-клеток, вирусной трансформации, антигенной и митогенной активации лимфоцитов [31, 32, 34], а также вопросов стромально-лимфоцитарных взаимодействий и выявления категорий стромальных клеток, необходимых для поддержания лимфопоэза.
Литература
1. Фриденштейн А. Я-, Лурия Е. А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. М., 1980. 214 с.
2. Metcalf D. The granulocyte-macrophage colony stimulating factors//Cell. 1985. Vol. 43. P. 5—6.
3. Messner H. A., Fauser A. A., Lepine Martin M. Properties of human pluripotent hemopoietic progenitors // Blood Cells. 1980. Vol. 6. P. 595—603.
4. Ckeever M. A., Greenberg P. D., Fefer A., Gillis S. Augmentation of the anti-tumor therapeutic efficacy of long-term cultured T lymphocytes by in vivo administration of purified interleukin 2//J. Exp. Med. 1982. Vol. 155. P. 968—980.
5. Лурия E. А. Кроветворная и лимфоидная ткань в культурах. М., 1972. 176 с.
6. Кузнецов С. А. Образование колоний фибробластов в культурах клеток костного мозга и селезенки в трехмерном коллагеновом геле // Докл. АН СССР. 1976. Т. 230. № 5. С. 1214—1217.
7. Lannote М., Sckor S., Dexter Т. М. Collagen gels as a matrix for haemopoiesis // J. Cell. Physiol. 1981. Vol. 106. P. 269—277.
8. Dexter Т. M„ Alien T. D.. Lajtha L. G. Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro//J. Cell. Physiol. 1977. Vol. 91. P. 335—344.
9. Moore M. A. S., Dexter Т. M. Stem cell regulation in continuous hematopoietic cell culture//Transplant. Proc. 1978. Vol. 10. P. 83—90.
