Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
и онкологических исследований. Гемопоэз в декстеровских культурах весьма чувствителен к экзогенным факторам различной природы (см. [27]); это позволяет использовать культуры для тестирования биологически активных веществ, в частности лекарственных препаратов. Перспективным представляется использование адгезивных слоев декстеровских культд» для наработки гуморальных регуляторов кроветворения. Очевидно, что перечисленные проблемы далеко не исчерпывают круг задач, для решения которых декстеровские культуры могут найти применение.
Лимфопоэз в культурах иа стромальиой подложке ^
Система,.позволяющая получить in vitro длительную пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцитов, по ряду параметров существенно отличается от декстеровской системы культивирования. Для эксплантации используют костный мозг мышей.многих линий (наилучшие культуры получены с линией BALB/c) 3—4-недельного возраста; использование более взрослых мышей дает неудовлетворительные результаты. Бедренные кости выделяют немедленно после умерщвления животного; все последующие операции проводят строго на холоду [31 ]. Жостный мозг выдувают из медуллярной полости в среду RPMI-1640 с 5 % эмбриональной сыворотки коров [32], разбивают осторожным пипетированием стеклянной пипеткой, осаждают центрифугированием и ресуспензируют в полной среде, доводя концентрацию до 1 • 106 ядерных клеток в 1 мл. Полученную суспензию не фильтруют, оставляя часть клеток в маленьких агрегатах [3!]. ‘
Для культивирования используют различные пластиковые сосуды (чашки Петри,.^матрасы, плэйты с колодцами); плотность эксплантации клеток для всех сосудов с площадью дна 20 см2 и более соблюдается постоянной: (2.5—2.6) 105 клеток на 1 см2 Культуральная
среда имеет следующий состав: RPMI-1640 с 5 % эмбриональной сыворотки коров, 5 • Ю'“2 М 2-меркаптоэтанола, 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина [31] . При более высоких концентрациях сыворотки в составе адгезивного слоя разрастаются категории стромальных клетсж, в дальнейшем не способствующие поддержанию лнмфопоэза. То же может произойти, если вместо RPM1-1640 использовать среду ДМЕМ (хотя для более поздних этапов культивирования она вполне пригодна). Партию эмбриональной сыворотки коров, благоприятную для развития адгезивного слоя и последующего лимфопоэза, необходимо подобрать заранее. Культивирование осуществляют в С02-инкубаторе (6 % С02 в воздухе) при температуре 37 °С. Подкормку культур производят дважды в неделю: каждые 3— 4-е сутки добавляют небольшую порцию (2/6 от общего количества) свежей среды, каждые 7-е сутки отбирают большую часть (около 75 %) старой среды, замещая ее таким количеством свежей, чтобы восстановить исходный объем.
Поставленные таким образом культуры проходят 4 последовательные фазы развития. В течение 1-й фазы (1—3 нед кульгивирова-
ния) на дне сосуда возникает и разрастается адгезивная подложка: к концу 2-й недели она состоит из стромальных очагов, которые, разрастаясь, к исходу 3-й недали сливаются, образуя конфлюэнтный подслой. Какая категория адгезивных клеток ответственна за последующее поддержание лимфопоэза, остается .неизвестным. Во всяком случае, эту роль играют не жировые клетки, которых в адгезивном слое мало [31]; повышенное их количество указывает лишь на высокую концентрацию в сыворотке кортикостероидов, ингибирующих рост и дифференцировку лимфоцитов и стимулирующих размножение гранулоцитов и макрофагов [31, 33]. Непригодными (в отличие от декстеровской системы) являются и такие культуры, в которых адгезивные очаги, соприкасаясь, не прекращают свой рост, а формируют многослойные гшаоты. Количество неадгезивных клеток в течение 1-й недели падает и в конце ее стабилизируется на уровне (1-*-2) • 105 клеток/мл. Миелопоэз затухает к концу 3-й недели культивирования, когда более 50 % плавающих клеток имеет морфологию лимфоцитов.
В течение 2-й фазы (3—6 нед после эксплантации) количество неадгезивных клеток падает почти до нулевых значений. Затем (начало 3-й фазы) на поверхности адгезивного слоя появляются маленькие фокусы круглых клеток, легко уходящих в среду при покачивании и имеющих на мазке морфологию лимфоцитов. Число круглых клеток (как плавающих, так и связанных с подложкой) быстро растет и через 2—3 нед достигает концентрации (1—3) • 10° клеток/мл; на этом уровне оно сохраняется в течение нескольких месяцев культивирования. В ранних (до 10 нед) культурах 70—80 % круглых клеток проявляет положительную реакцию на цитоплазматические иммуноглобулины, но не несет поверхностных иммуноглобулинов, т. е. является пре-В-лимфоцитами. Позднее доля клеток, несущих мембранные IgM, увеличивается, достигая 80—100 %, чго иллюстрирует созревание В-лимфоцитов; еще позднее преобладающими становятся В-лимфоциты, несущие также мембранные IgD [31]. Популяция синтезируемых В-лимфоцитами тяжелых и легких целей иммуноглобулинов является гетерогенной; это означает, что в культурах образуются предшественники В-клеток, несущие неперестроенные гены иммуноглобулинов (лимфоидные стволовые клетки) [31, 33]. Другое доказательство наличия в культурах ранних, недифференцированных, предшественников линии В-лимфоцитов состоит в том, что клетки из таких культур могут репопулировать дефектный В-клсточ-ный компартмент у CBA/N иммунодефицитных мышей [32]. Клетки, секретирующие иммуноглобулины, в культурах отсутствуют. Не обнаружены также клетки, несущие поверхностные антигены Thy-'l или Мас-1, и клетки, способные к образованию колоний в селезенке облученных мышей, т. е. СКК [32]. В культурах содержатся лимфоциты, которые могут быть трансформированы ^вирусом мышиной лейкемии Абельсона; в результате образуются автономные клональные клеточные линии, удобные для биохимического анализа [31, 33, 34].
