Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Идентификация мышечных клеток и очистка их
от сопутствующих клеточных типов
Сердце — гетерогенный по клеточному составу орган: в миокарде взрослых крыс на долю миоцитов приходится лишь около 20 % от общей численности клеток [21], поэтому, как и при работе с гетерогенными клеточными популяциями, полученными из других органов (печени, поджелудочной железы, почки, скелетной и гладкой мускулатуры), возникает необходимость типирования клеток, в первую очередь мышечных. Большинство немышечных клеток составляют фибробласты, клетки выстилок сердца и эндотелий сосудов. Свежевыделенные дифференцированные кардиомиоциты легко идентифицируются по характерной палочковидной форме и поперечной исчер-ченности (см. рисунок, а и б, вклейка), выявляемым при фазовоконтрастном микроскопировании.
Очищенные фракции мышечных клеток можно получить центрифугированием в градиенте плотности фиколла или перколла («Pharmacia»). Градиенты плотности этих химически инертных агентов, обычно использующиеся для очистки лимфоцитов из препаратов цельной крови, позволяют получать фракции, состоящтте'на 90 % и более из неповрежденных мышечных клеток. Метод разделения мышечных и немышечных клеток в градиенте плотности фиколла предложен и затем усовершенствован Кутилеттой с соавторами [22, 23]. Суспензию свежеизолированных клеток центрифугируют
3 мин в физиологическом растворе при 50 g. Супернатант сохраняют для выделения немышечных клеток; осадок, содержащий в основном миоциты, промывают в изотоничном фосфатном буфере, pH 7.4, и суспензируют в 5 мл этого буфера. Полученную суспензию наслаивают на 5 мл 3 %-ного (масса/объем) раствора фиколла в том же буфере и дважды центрифугируют при 67 g 3 мин. Оба супернатанта объединяют и центрифугируют при 800 g в течение 10 мин, получая таким образом фракцию немышечных клеток. Полученные фракции мышечных и немышечных клеток дважды промывают от фиколла. Во фракции мышечных клеток миоциты составляют более 90%.
В другой (сходной) схеме изоляции миоцитов из суспензий клеток миокарда в градиенте фиколла [24] был использован 2 %-ный фиколл и все процедуры с клетками выполнялись в растворе Хэикса. Этот метод хорошо воспроизводится и позволяет получать довольно чистые фракции кардиомиоцитов.
Для получения толерантных к Са2+ кардиомиоцитов в градиенте плотности перколла2 [20] свежеизолированные клетки инкубировали в течение 20 мин при 37 °С в среде Джоклика (модификация среды МЕМ), не содержащей СаСЬ. За это время миоциты прекращают спонтанные сокращения. Затем суспензию наслаивают на 12 мл 50 %-ного (объем/объем) раствора перколла, содержащего
11.3 мг/мл среды Джоклика, 2 мг/мл ЫаНСОз и 2 • 10~3 М СаСЬ.
2 Следует учитывать гипоосмотичность перколла.
После центрифугирования при 2000 g и 25 °С в течение 45 мин живые клетки концентрируются в области с плотностью 1.08 г/мл. Клетки собирают и промывают от перколла центрифугированием дважды при 37 g, полученный осадок миоцитов ресуспензируют в среде Джок-лика, содержащей 1 % бычьего сывороточного альбумина и 2 • 10_3 М СаСЬ- Было показано [20], что при центрифугировании в градиенте перколла удаляется значительная часть погибших клеток, при этом до 90 % клеток полученной фракции жизнеспособны и имеют палочковидную форму.
Приведенные выше методики, несмотря на их высокую эффективность, требуют тщательного отмывания от среды градиента, что увеличивает продолжительность опыта и неизбежно ведет к потерям клеток. Однако они представляют собой важное методическое усовершенствование для работ по метаболизму клеток миокарда, так как биохимические исследования кардиомиоцитов практически целиком выполняются на тотальных гомогенатах ткани сердца.
Численность немышечных и погибших клеток в препарате значительно уменьшается после 15 мин отстаивания пробирки с суспензией при 1 g за счет более быстрого оседания мышечных клеток на дно, что позволяет избежать центрифугирования, снижающего выживаемость клеток [14, 25].
Мышечные и немышечные клетки можно разделять уже после посева смешанной клеточной суспензии на основании различий в скорости их прикрепления к стеклу. Методика раздельного прикрепления (differential attachment technique) подробно описана [26] для культур миокарда новорожденных крыс. Она заключается в перенесении среды, содержащей медленно прикрепляющиеся к стеклу мышечные клетки, в другую посуду через 1—4 ч после посева смешанной суспензии (время, достаточное для адгезии на стекле фибробластов и эндотелия). Аналогичная процедура для клеток, культивируемых в заполненных средой камерах, проводится переворачиванием камеры после прикрепления немышечных клеток [26]. Преимущество этого метода состоит в его физиологичности, отсутствии контакта клеток с какими-либо химическими агентами, что обусловливает его частую применяемость.
Рост фибробластов резко задерживается, а кардиомиоциты хорошо сохраняют функциональную активность (как показано для клеток эмбрионов курицы) при культивировании в среде без глютамина [27].
При необходимости длительного культивирования клеток даже минимальное попадание в культуру фибробластов, обладающих очень высокой пролиферативной активностью, приводит к быстрому ее зарастанию немышечными клетками. Эффективное удаление немышечных клеток достигается обработкой культур цитостатиками; при этом вышедшие из митотического цикла дифференцированные кардиомиоциты сохраняют жизнеспособность, тогда как немышечные клетки погибают. В этом отношении наиболее пригодны ингибиторы синтеза ДНК ввиду минимального их влияния на метабо-
