Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
лизм покоящихся мышечных клеток. Практически полная очистка культуры миокарда крысы от немышечных клеток достигается двукратной обработкой цитозинарабинозидом: 14 мкг на 1 мл среды в 1-е сутки после посева и 3 мкг на 1 мл на 4-е сутки с удалением ингибитора на 8-е сутки культивирования [28]. Меньшая концентрация цитостатика (2.8 мкг/мл) при такой же схеме введения также приводит к удалению более чем 99% немышечных клеток [14]. Вполне удовлетворительный эффект, по нашим наблюдениям, дает 4-суточная обработка культуры цитозинарабинозидом в концентрации 3 мкг на 1 мл среды. Рост немышечных клеток тормозится при ингибировании в течение 3—4 сут синтеза ДНК 2.5 • 10“3М тимиди-ном, являющимся в отличие от цитозинарабинозида естественным метаболитом клетки.
Кардиомиоциты в культуре отчетливо идентифицируются в фазовом контрасте по типу распластывания, характерной форме, малым размерам ядра (содержащего, как правило, единственное ядрышко), плотной цитоплазме с включениями гликогена и крупным отросткам, часто раздвоенным на концах (см. рисунок, в, вклейка). Так как в процессе распластывания сократительный аппарат перераспределяется по объему клетки (в отличие от строго продольной его укладки в свежеизолированных клетках), поперечная исчерченность обнаруживается лишь в отдельных участках цитоплазмы.
На постоянных препаратах кардиомиоциты выявляются любой цитохимической реакцией на гликоген, например PAS-реакцией, для проведения которой [29] клетки промывают в холодном физиологическом растворе и фиксируют в смеси спирта с нейтральным формалином (9:1) в течение 24 ч при 4 °С, после чего отмывают от фиксатора в 95 %-ном спирте и проводят через серию спиртов в воду. В течение 30 мин обрабатывают 1 %-ным водным раствором йодной кислоты, промывают в воде и окрашивают в реактиве Шиффа 10 мин, затем трижды по 2 мин промывают водой и высушивают на воздухе. Цитоплазма мышечных клеток при этом окрашивается в розово-красный цвет, тогда как немышечные клетки PAS-нега-тивны (см. рисунок, гид, вклейка).
Культивирование клеток
Большинство работ по культивированию клеток сердца выполнено на кардиомиоцитах крыс, что обусловлено доступностью и удобством экспериментов с этими животными. В меньшей степени используются эмбриональные клетки курицы [30], мыши [31] и редко, ввиду трудности культивирования, эмбрионов человека (см. [32]). Значительным методическим достижением является успешное культивирование кардиомиоцитов взрослых людей [32]. За последние годы возрос интерес к получению культур мышечных клеток из различных отделов сердца, в первую очередь миоцитов предсердий, обладающих двойственной, сократительной и секреторной, функцией. Были получены первичные культуры миоцитов предсердий обезьяны [33], крысы [34, 35], синоатриального узла крысы [36] и собаки [37] и интрамурального ганглия сердца морской свинки [38, 39]. Все названные
типы клеток сохраняют in vitro присущие им функционально-морфологические особенности.
Культуры кардиомиоцитов поддерживают в обычных для культивирования клеток средах: Игла, часто в модификации Дульбекко (DMEM) или Игла (ЕМЕМ), а также в более богатых средах F-10 и F-12 с добавлением 10 % эмбриональной сыворотки коров. Вместо эмбриональной можно использовать отдельные партии сыворотки крови лошади [5] и, по нашим наблюдениям, предварительно отсе-лектированные серии сыворотки крупного рогатого скота. Выживание клеток и эффективность посева значительно увеличиваются в минимальной среде Игла, кондиционированной клетками роговицы кролика и содержащей наряду с сывороткой дополнительные аминокислоты, витамины и следовые количества неорганических микроэлементов [14]. Показана возможность культивирования клеток миокарда в бессывороточных средах фиксированного химического состава [40, 41]. Прикрепление миоцитов к стеклу ускоряется на поверхностях, покрытых коллагеном, причем наиболее предпочтителен коллаген типа IV, а также другие белки, улучшающие распластывание,— ламинин и в меньшей степени фибронектин [14, 15].
При распластывании форма клеток изменяется от округлой или палочковидной до полигонально-звездчатой (см. рисунок, бив, вклейка). Кардиомиоциты сохраняют жизнеспособность и сократительную активность до 2 мес [19, 26]. При пассировании клеточных культур миокарда выживают главным образом немышечные клетки, что, по-видимому, связано с прочным прикреплением миоцитов к подложке, необходимым прн сократительной функции. Попытки получения постоянных клеточных линий сердца [42—44] привели к выделению пассируемых штаммов, не обладающих, однако, морфологическими и физиологическими свойствами кардиомиоцитов.
Таким образом, обобщая вышеизложенное, можно выделить две методические схемы получения первичных культур мышечных клеток сердца.
Клеточные культуры развивающегося миокарда. Ткань миокарда (эмбрионы крысы — 14—20-суточные, курицы — 7—11-суточные, человека— 7—16-недельные) отмывают от крови в бескальциевом растворе Хэнкса и, измельчив, инкубируют в 0.15 %-ном растворе трипсина, содержащем 0,05 % коллагеназы, в течение 20 мин при 37 °С. После удаления протеолитических ферментов ткань промывают дважды в питательной среде с 10 % сыворотки и суспензируют клетки встряхиванием флакона или пипетированием (5—8 раз пипеткой на 10 мл с широким отверстием); 15—20-минутные циклы трипсинизации повторяют до полной диссоциации ткани и перехода в суспензию свободных клеток (обычно 3—4 раза). Процедура диссоциации проводится в бескальциевой среде. Клетки высевают либо сразу, либо после центрифугирования (1000 об/мин в настольной центрифуге в течение 7—10 мин), позволяющего удалить часть погибших клеток. Мышечная фракция очищается методом раздельного прикрепления или культивированием в среде без глютамина. Применение для эмбриональных культур цитостатиков нецелесо-
