Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Культуральный тест на КОКф используется прежде всего для подсчета стромальных колоний. Отношение количества колоний к числу эксплантированных клеток характеризует эффективность колониеобразования (ЭКОф). По ЭКОф можно судить о численности КОКф в кроветворных органах, в том числе в условиях
патологии у человека, о свойствах КОКф, например, о спектре их антигенов и рецепторов, о чувствительности КОКф к облучению, действию цитостатиков и т. д. В последнем случае проводится сравнение ЭКОф при эксплантации исходных клеточных суспензий и тех же суспензий, обработанных антителами, лигандами, цито-статиками или подвергнутых облучению. Тест на КОКф используется также для изучения свойств культуральных потомков стволовых стромальных клеток.
Условия, в которых проводится тест, могут влиять как на ЭКОф, так и на клеточный состав стромальных колоний. Ниже на примере костномозговых КОКф описываются последовательные этапы проведения теста и разбирается, как каждый из этих этапов может влиять на получаемые результаты. Те же приемы культивирования применяются и для выявления КОКф лимфоидных органов — селезенки, лимфатических узлов и тимуса.
Приготовление клеточных суспензий. КОКф принадлежат к ретикулярной строме кроветворных и лимфоидных органов. Все ли ее клетки связаны между собой одинаковыми по прочности межклеточными контактами, остается неизвестным. Поэтому разные способы дезагрегации клеток при приготовлении суспензии могут высвобождать из кроветворной ткани различные субпопуляции ее стромальных клеток. Для проведения теста на КОКф используются два способа получения клеточных суспензий — механическая или энзиматическая дезагрегация клеток. Механическая дезагрегация ткани костного мозга проводится в фосфатном буфере путем повторного пропускания тканевых фрагментов через пастеровскую пипетку, а затем через шприц с иглами уменьшающегося диаметра. Пропускание через шприц должно производиться медленно, чтобы давление внутри шприца было небольшим. Энзиматическая дезагрегация заключается в обработке фрагментов костномозговой ткани иа магнитной мешалке 0.25 %-ным раствором трипсина с виаказой или ДНКазой. Трипсинизация продолжается 30 мин при комнатной температуре, после чего полученную взвесь пропускают несколько раз через шприц с иглами уменьшающегося диаметра. Обязательный заключительный этап при приготовлении клеточных суспензий состоит в их фильтрации через 4-слойный капроновый фильтр для удаления оставшихся стромальных агрегатов. Контроль за полнотой дезагрегации проводится путем пробной адгезии. Для этого профильтрованные клетки помещают в культуральные матрасы, поверхность которых покрыта полилизином. На 1 см2 поверхности помещают по 4 • 10 клеток, и через 30 мин, когда все клетки успевают прикрепиться, матрасы фиксируют 80 %-ным этанолом, окрашивают азур-эозином и определяют, сколько в них находится стромальных клеточных агрегатов. В правильно приготовленной суспензии их должно быть не более трех на каждые 106 костномозговых клеток. Перед эксплантацией костномозговые клетки осаждают центрифугированием и ресуспензируют в культуральной среде с 2 % сыворотки. Подсчет клеток в гемоцитометре производится дважды — после фильтрования и после ресуспензирования в среде с сывороткой.
Все манипуляции с момента выделения костного мозга проводятся при 4 °С, за исключением трипсинизации.
Культуральная среда. Для культивирования используется синтетическая среда с добавлением 1(0—20 % сыворотки. Тип культуральной среды может сильно влиять на ЭКОф, и поэтому для каждой клеточной популяции синтетическую среду следует подбирать и апробировать. Это в равной степени относится и к сыворотке. Лучшие результаты получаются при использовании свежеразведен-ных синтетических сред и сывороток, которые до употребления хранятся в замороженном состоянии. Тест на КОКф человека, морских свинок и кроликов может проводиться на среде 199; на КОКф крыс и мышей — на среде RPMI-1640. Наилучшие результаты получаются, однако, при использовании свежеприготовленной среды а-МЕМ. Для КОКф мышей, морских свинок, крыс и кроликов следует применять эмбриональную сыворотку коров, а для КОКф человека — человеческую сыворотку IV группы. Сыворотки перед употреблением не 'подогревают, и очень желательно использовать специально отобранные партии сывороток, которые обеспечивают высокую ЭКОф.
Посуда. Для культивирования пригодны стеклянные и пластиковые матрасы, чашки Петри и пластиковые 24-луночные плейты. КОКф и их культуральные потомки — это высокоадгезивные клетки, и качество субстрата, к которому они прикрепляются, сильно влияет на рост колоний. Использование выщелоченной стеклянной посуды и пластика низкого качества может снижать ЭКОф и неблагоприятно рлиять чт клеточный состав колоний. При оценке пригодности среды »и посуды для постановки теста ка КОКф следует исходить из того, что костномозговые клетки, полученные путем механической дезагрегации, имеют ЭКОф не ниже 3 • 10-5.
Эксплантационная плотность. Фидерные клетки. Правильный выбор эксплантационной плотности составляет ключевой момент проведения теста ваЩЖф. Следует исходить из количества костномозговых клеток, приходящихся на единицу поверхности культурального сосуда, и учитывать при этом два главных момента. Тест на КОКф основан на том, что концентрация КОКф среди костномозговых клеток не превышает обычно 10”4 в клеточных суспензиях, полученных путем трипсинизации, и 10~5 в суспензиях механически дезагрегированных клеток. Поэтому при эксплантации с небольшой исходной плотностью КОКф оказываются достаточно разобщенными друг от друга и на 10—12-е сутки, когда ст;ромальные колонии имеют в своем составе до 104 фибробластов, эти колонии располагаются на достаточно большом расстоянии друг от друга, чтобы их можно было учесть как дискретные очаги фибробластическотаэ роста. В связи'С этим эксплантационная плотность костномозговых клеток не должна превышать 104 и 103 соответственно для механически дезагрегированных и трилсинизированных костномозговых клеток на 1 см2 поверхности кульгурального сосуда.
