Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В течение недели следят только за цветом среды. Изменение цвета индикатора к желто-оранжевому свидетельствует о хорошем состоянии эксплантата. Спустя неделю начинают периодически (через сутки) просматривать культуру под микроскопом. Можно использовать как инвертированный микроскоп, так и обычный. В последнем случае следует осторожно повернуть флакон, при этом стекла с культурой прилипают к боковой стороне флакона и могут быть исследованы при малом увеличении. Вокруг кусочков появляются вначале единичные фибробласты, которые заметны в виде длинных веретеновидных клеток, либо появляется слой эпителия, окружающего фрагмент в виде «кружевного» ореола. При появлении зоны выроста клеток следует сменить среду. Когда клетки займут все пространство между кусочками (это видно невооруженным глазом или при помощи лупы), клетки пересевают. Указать точные сроки наступления момента пересева не представляется возможным, поскольку скорость выроста клеток варьирует от индивидуума к индивидууму, сильно зависит от возраста донора (чем старше донор, тем медленнее происходит миграция клеток из эксплантата), от качества питательной среды.
Пересев клеток. Удаляют питательную среду из сосуда и наливают 2—3 мл заранее подогретого раствора трипсина (0.25 %-ного) или смесь версен—трипсин. Через 2 мин удаляют трипсин, оставив его только между стеклами. Инкубируют 15—20 мин в термостате при 37 °С. Срок инкубации может сильно варьировать в зависимости от качества трипсина. Ход трипсинизации можно контролировать, просматривая культуры под микроскопом. По окончании трипсинизации при помощи препаровальной иглы отделяют одно стекло от другого и при помощи тонко оттянутой пипетки смывают клетки небольшим (1 мл) количеством среды. При этом тщательно пипетируют (несколько раз пропускают через пипетку) суспензию клеток и кусочки. Суспензию клеток переносят в небольшой флакон Карреля (или сосуд Коля) или в пенициллиновый флакон и добавляют среду до 2—3 мл. Оставшиеся в прежнем сосуде кусочки снова укладывают между двух покровных стекол и заливают средой.
От этих вторично культивируемых эксплантатов может быть получен второй «урожай» клеток. Флакон Карреля с растущими фибробластами просматривают ежесуточно под микроскопом. Когда образуется слившийся слой клеток, производят второй, пересев (обычно через 4—7 сут). Для пересева удаляют среду, вносят в сосуд 2—3 мл раствора версена, слегка покачивая сосуд, смачивают
этим раствором слой клеток. Удаляют раствор версена и вносят
2—3 мл раствора трипсина, который удаляют в течение 1 мин, оставив слой клеток, смоченный трипсином. Инкубируют флакон в термостате в течение 15—20 мин. Клетки смывают струей питательной среды, несколько раз пропустив суспензию через пипетку. Пересев производят в отношении 1 : 2, т. е. из одного сосуда клетки распределяют в два или в один, но большего объема. Пересевы производят 1 раз в неделю (частота пересевов зависит от скорости образования слившегося слоя, которая значительно варьирует и в зависимости от возраста донора). Пересевы производят до получения количества клеток, достаточного для цитогенетического или биохимического исследования и для криоконсервации.
Клеточный штамм считают установившимся, если после пассирования в течение первых 5 пассажей прирост клеток спустя 3—4 сут после пересева превосходит количество посеянных минимум вдвое, что и позволяет пересевать такие клетки в отношении 1 : 2.
Имеются существенные различия по целому ряду характеристик, в том числе и по скорости роста, между клеточными штаммами эмбрионального и постнатального происхождения, а также между индивидуальными штаммами. По мере увеличения числа пассажей, после некоторого периода, начинается снижение пролиферативного потенциала клеток, что проявляется в увеличении времени, необходимого для достижения прироста, обеспечивающего пересев 1 : 2. При дальнейшем увеличении числа пересевов прирост вовсе прекращается, и в конце концов штамм дегенерирует. Следует подчеркнуть, что, вопреки распространенному мнению, не существует какого-то определенного числа пассажей, ограничивающего продолжительность жизни штамма фибробластов в культуре. Это число сильно варьирует в зависимости от качества и состава питательных сред, от посуды, частоты пересевов. Важнейшим фактором, как уже указывалось, является межштаммовая изменчивость пролиферативного потенциала, являющаяся генетической характеристикой. Однако существует общее правило, которое можно считать твердо установленным, — фибробласты, полученные от эмбрионов, способны претерпеть большее количество пассажей, чем фибробласты, полученные от взрослых индивидуумов. Однако при исследовании большого количества штаммов можно обнаружить эмбриональные штаммы с низким пролиферативным потенциалом и постнатальные — с высоким.
Основываясь на опыте получения более чем 1000 штаммов фибробластов человека, мы можем рекомендовать вести установившиеся штаммы при следующих посевных концентрациях клеток: в матрас емкостью 100 мл вносят 1 млн. клеток и 20 мл среды, 250 мл — 2— 2.5 млн. клеток и 40 мл среды, 1000 мл — 10 млн. клеток и 150—200 мл среды. При таких концентрациях клеток сплошной слой образуется на 3—7-е сутки культивирования.
