Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Использование культивируемых клеток вне организма для диагностики наследственных болезней является логическим продолжением метода биопсии, при котором изъятый из организма фрагмент ткани подвергается немедленному (преимущественно морфологическому) исследованию. Однако благодаря культивированию возможности исследования и диагностики расширяются практически беспредельно, так как имеется возможность оценки не только морфологических и биохимических изменений, но и изменений в поведении клеток, их реакций на различные агенты, в том числе на лекарственные воздействия. Воспроизведение культивируемыми клетками в ряду поколений какого-либо дефекта или изменения, свойственного клеткам in vivo, свидетельствует о наследственной природе этого дефекта или изменения. Именно это обстоятельство делает культивируемые фибробласты ценным объектом физиологической генетики [8]. Благодаря методу культивирования клеток патология человека и антропология становятся экспериментальными науками.
Вопрос о возможности и пределах экстраполяции данных, полученных на культивируемых фибробластах, на условия in vivo уже разбирался одним из авторов [9]. Было показаног что по целому ряду важнейших свойств фибробласты in vitro неотличимы от фибро-бластов in vivo. Недавно этот же вопрос кратко и убедительно разобран одним из пионеров широкого использования культуры фибробластов для диагностики наследственных болезней [10]:
1) фибробласты in vitro сохраняют важнейшие черты, свойственные этим клеткам в организме; более того, они сохраняют онтогенетические и индивидуально-генотипические свойства организма-донора;
2) не существует другого типа клеток, который в полной мере мог бы представлять свойства клеток организма; 3) изменения, которые возникают при введении фибробластов в культуру, можно легко контролировать и свести к минимуму путем создания соответствующих условий.
Источники получения фибробластов. Рост фибробластов (или фибробластоподобных клеток) может быть получен из многих тканей и органов. На практике используются фибробласты дермального слоя кожи (биопсия и некропсия), фибробласты кожно-мышечного и легочного происхождения (материал медицинских и спонтанных
абортов). Преобладающий рост фибробластов наблюдается при культивировании некоторых образцов амниотических клеток (клеток околоплодной жидкости) и мочи.
Взятие биопсии. Поскольку имеются данные о том, что биологические особенности фибробластов варьируют в зависимости от мест взятия эксплантата, необходимо придерживаться стандартного метода взятия биопсии. Наиболее удобным местом является внутренняя сторона предплечья левой руки (нижняя треть). Кожу дезинфицируют 70 %-ным этиловым спиртом. Не рекомендуется употреблять другие дезинфицирующие растворы (например, настойку йода), так как в случае проникновения их в биоптат они могут оказать токсическое действие. При взятии биопсии у детей необходимо фиксировать руку в локтевом сгибе и в запястье. После дезинфекции кожу захватывают глазным хирургическим пинцетом, оттягивают, насколько это возможно, и отсекают кусочек кожи непосредственно под браншами пинцета. Не следует стремиться брать глубокие слои кожи.
При правильно взятой биопсии, захватывающей эпидермис и сосочковый слой дермы, кровотечение минимально. Наш многолетний опыт свидетельствует о том, что в обезболивании нет никакой необходимости. Отсечение кожи лучше всего производить половинкой лезвия безопасной бритвы. Пинцет и бритва стерилизуются путем погружения в этиловый спирт с последующим поджиганием. Отсеченный кусочек немедленно погружается в заранее подготовленный пенициллиновый флакон с питательной средой. Флакон герметически закрывают, пробкой и немедленно надписывают (фамилию пациента, его кодовый номер или номер истории болезни). На рану накладывают бактерицидный пластырь, детям, кроме того, накладывают повязку. При соблюдении правил асептики и антисептики ранка быстро заживает. Осложнений в виде нагноения мы никогда не наблюдали. Повязка может быть удалена через 3 сут.
Фрагмент кожи в питательной среде может сохраняться при
4 °С в течение 3—4 сут без утраты фибробластами способности к росту. Образцы можно пересылать железнодорожным или авиатранспортом. По нашим наблюдениям, биоптаты не теряют жизнеспособности после транспортировки при комнатной температуре в течение 1—2 сут.
Кожа для культивирования может быть взята у трупа (некроп-сия) при хранении в надлежащих условиях даже спустя 24 ч после смерти.
Получение эксплантата. В стерильную чашку Петри с каплей трипсина (0.25 %-ный раствор) или питательной среды (предохраняет от высыхания) помещают фрагмент кожи. Придерживая фрагмент пинцетом, нарезают его на мелкие кусочки величиной с булавочную головку и меньше стерильным лезвием безопасной бритвы, зажатой в зажим Кохера или Пеана. При помощи изогнутой препаровальной иглы кусочки извлекают из капли и помещают на покровное стекло, находящееся в пенициллиновом флаконе или в пробирке Лейтона. Уложенные кусочки накрывают другим покров-
ным стеклом, слегка прижимая его препаровальной иглой. Наливают в культуральный сосуд питательную среду так, чтобы она покрыла верхнее стекло. Покровные стекла с зажатыми между ними кусочками кожи при помощи пинцета кладут на боковую сторону пенициллинового флакона. Флаконы устанавливают на специальной подставке под углом примерно в 30 °. В случае использования пробирок Лейтона необходимость в этом отпадает. Флаконы плотно закрывают пробкой. Культуры инкубируют б термостате при 37 °С.
