Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 131

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 171 >> Следующая

При пересевах линий клеток яичника шелкопряда пользуются 0.1 %-ным раствором трипсина «Difco», приготовленного на солевом растворе среды Г рейса [23]. Старую среду сливают, к монослою клеток добавляют раствор трипсина, инкубируют при 25 °С и, как только клетки начинают отслаиваться от стекла, в сосуд добавляют свежую полную питательную среду и осторожно пипетируют, чтобы освободить клетки от субстрата. После центрифугирования при 1000 об/мин в течение 2 мин надосадок отбрасывают, а клетки ресус-пензируют в свежей питательной среде из расчета 5 • 104—1 • 105 клеток/мл.
Время генерации пересеваемых линий клеток насекомых занимает от 18—24 [50, 56] до 72 ч [21]. В наших условиях культивирования
при посеве (1 —1.5)- 10е клеток/мл линии 67j25D в пластмассовые плато («Nunc», Дания) размером 24X24 см в 100 мл среды КШ-10+ +2 % эмбриональной сыворотки коров фирмы («Gibco», США), на 7-е сутки урожай клеток достигал (10—15) • 106 клеток/мл, т. е. около 1 млрд. клеток.
Замораживание клеток насекомых
1-й способ. Клетки, росшие в 4 мл среды в течение 4—7 сут, освобождают от старой среды, суспензируют в среде для замораживания (75 % среды, 15 % сыворотки и 10 % ДМСО), доводя концентрацию клеток до 2 • 106 клеток/мл. Эту суспензию разливают в 4 полиэтиленовые пробирки по 1 —1.2 мл. На маркирование ампул и размещение их в пенопластовой коробке с ячейками для пробирок идет около
8 мин. Готовый пакет ампул помещают в рефрижератор при —70 °С, через 2 ч или более ампулы переносят в сосуд Дюара с жидким азотом (—196 °С).
При оттаивании ампулу быстро переносят (около 30 с) в сосуд с водой 37 °С. Вскоре, как только исчезают последние кристаллы льда, ампулу открывают, обжигают края и содержимое переносят пастеровской пипеткой в предварительно охлажденную пробирку с холодной средой в объеме 5 мл. Центрифугируют 2—3 мин при 2000 об/мин, среду выбрасывают, клетки ресуспензируют в среде комнатной температуры, разливают в 4 флакона Карреля, где концентрация клеток не превышает 0.8 • 106 клеток/мл.
2-й способ. (2—5) • 4 0б клеток/мл в среде КШ-10 (75 %), содержащей эмбриональную сыворотку коров (15%) и глицерин (10 %), разливают по полиэтиленовым ампулам по 1 —1.2 мл. Ампулы помещают в металлический стакан и держат 1 ч в холодильнике при 4 °С. После этого стакан подвешивают над сосудом Дюара цилиндрической формы, на '/г заполненным жидким азотом (15 мин), затем стакан опускают в цилиндр вровень с краем и оставляют на 15 мин, далее стакан опускают до касания с жидким азотом и тут же поднимают на 1 см, оставляют на 20 мин, потом стакан медленно погружают в жидкий азот. Такой режим заморозки примерно соответствует скорости 1 °С в 1 мин. При размораживании ампулы помещают в воду (при 29—32 °С) для быстрого оттаивания (1—2 мин). Клетки дрозофилы, хранящиеся при 4 °С, не теряют способности к активному росту по крайней мере в течение 1 мес.
В заключение надо отметить, что культуры клеток беспозвоночных представляют огромный интерес для изучения молекулярных механизмов взаимодействия хозяин—паразит [57, 58], роли мобильных генетических элементов в адаптации беспозвоночных к стрессовым условиям окружающей среды [59], регуляции действия генов в клетках высших организмов [27, 60, 61] и клеточных механизмов диффе-ренцировки и трансдетерминации в процессе метаморфоза [38, 53], а также специфической генетической реакции (пуффинг) гигантских политенных хромосом слюнных желез Diptera, культивируемых в химически определенной среде, содержащей известные биологически активные соединения [46—48].
1. Hink W. F. The 1979 compilation of invertebrate cell lines and culture media // Invertebrate systems in vitro / Eds. E. Kurstak, K- Maramorosch. Amsterdam etc., 1980. P. 553—578.
2. Invertebrate tissue culture / Ed. C. Vago. New York; London, 1972. Vol. 2. P. 426.
3. Tissue culture methods and applications / Eds P. F. Kruse Ir., М. K. Patterson Ir. New York; London. 1973. 868 p.
4. Invertebrate systems in vitro / Eds. E. Kurstak, K- Maramorosch, A. Diibendorfer. Amsterdam, 1980. 398 p.
5. Advances in cell culture / Ed. K. Maramorosch. New York, 1981. Vol. 1. 340 p.
6. Милосердова В. Д. Культивирование клеток насекомых вне организма // Цитология и генетика. 1967. Т. 1. С. 78—89.
7. Echalier G. In vitro established lines of Drosophila cells and application in physiological genetics // Invertebrate tissue culture: Application in medicine, biology and agriculture / Eds E. Kurstak, K. Maramorosch. New York; London, 1976 P. 131 — 150.
8. Echalier G. Necessity of radically new insect cell culture methods // Invertebrate system in vitro / Eds. E. Kurstak, K. Maramorosch, A. Dubendorfer. Amsterdam etc.,
1980. P. 589—592.
9. Bernhard H. P., Lienhard S., Regenass U. Isolation and characterization of mutant Drosophila cell lines // Invertebrate systems in vitro / Eds. E. Kurstak, K. Maramorosch, A. Dubendorfer. Amsterdam etc., 1980. P. 13—26.
10. Sang I. H. Drosophila cells and cell lines // Advances in cell culture / Ed. K. Maramorosch. New York, 1981. Vol. 1. P. 125—182.
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed