Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Для более надежной стерилизации эмбрионов и облегчения проницаемости удаляют хорионовую оболочку яйца. Наиболее быстрый метод состоит в обработке яиц 3—5 %-ным раствором гипохлорита натрия в течение 2—3 мин с последующей тщательной отмывкой стерильной дистиллированной водой. Выживаемость дехорионизиро-ванных эмбрионов снижается до 40—60 %. Гипохлорит натрия
(NaCIO) можно получить по следующей прописи [33J: берут 25 г Са (СЮ) г, растворяют в 42 мл водопроводной воды; 17.5 г Na2C03 (натрий углекислый) растворяют в 42 мл водопроводной воды. Полученные растворы смешивают (смесь сначала загустевает, затем вновь разжижается). Полученную смесь фильтруют через полотняный фильтр. Светлый желтоватый раствор (около 67 мл) содержит примерно 6—10 % NaCIO. Дехорионизация яиц осуществляется в 3—5 %-ном растворе на 48 %-ном этаноле в течение 2—5 мин, когда полностью растворяется хорионовая оболочка эмбриона. Отмытые яйца помещают в пробирки с автоклавированным при 0.7 атм 20 мин • кормом следующего состава: СаС12 — 0.54 г, манка — 126 г, свежие дрожжи — 220 г, агар — 8.9 г, вода — до 1000 мл [34]. Вылупившихся мух стерильно переносят в новые пробирки с автоклавированным кормом. Таким способом в течение нескольких лет удается содержать безмикробные культуры дрозофилы, дающие стерильные ткани на любых стадиях развития насекомого.
Культивирование целых эмбрионов,
нмагииальных дисков и органов насекомых
Эмбрионы с удаленной или просветленной оболочкой (хорионом) используются для изучения начальных стадий развития насекомых [35].
Имагинальные диски. Имагинальные диски — зачатки органов взрослого насекомого — широко используются для исследования процессов дифференцировки in vitro [10, 14, 15, 36—42]. При этом обычно используют метод висячей капли объемом 0.005—0.008 мл [15]. Например, имагинальные диски дрозофилы изолируют из стерильных личинок третьего возраста, которые различаются по развитию дыхательного бугорка и по окраске ротового аппарата личинок [41, 43]. Личинок, снятых со стенок пробирки, отмывают многократным погружением в автоклавированную дистиллированную воду в чашке Петри. Затем отмытые личинки пинцетом переносят в чашку Петри диаметром 40—60 мм, содержащую 2—4 мл стерильной среды. Придерживая личинку препаровальной иглой, отсекают переднюю часть тела в области первых четырех сегментов с помощью тонкой вольфрамовой иглы, заточенной путем электролиза. Затем из передней отсеченной части осторожно выдавливают имагинальные диски в комплексе с головным и брюшным ганглиями и переносят их пинцетом в другую чашку Петри со свежей питательной средой, где комплексы освобождают от трахей. Имагинальные диски 3 раза отмывают, перенося их из одной капли среды в другую, после чего их помещают в сосуд для культивирования, выбор которого зависит от массы взятой ткани и объема среды. Обычно берут 10—20 имагиналь-ных дисков вместе с головным и брюшным ганглиями в объеме 0.2 мл среды и инкубируют при 28 °С [41].
Пересеваемая линия клеток имагинальных дисков. Лин и Обер-ландер [42, 44] впервые описали получение пересеваемой линии из крыловых имагинальных дисков Lepidoptera. Исходные культуры со-
держали 20—40 крыловых имагинальных дисков. Ткани культивировались в стоячей капле (объем 0.2 мл) модифицированной среды Грейса [23], содержащей 8% гретой эмбриональной сыворотки коров, в 35 мм чашках Петри, герметически закрытых парафильмом, и инкубировали при 26 °С и 95 %-ноЙ! относительной влажности. После 48 ч в каплю добавляли еще 1 мл питательной среды. Через 5—10-суточные интервалы вплоть до пересева среду на 50 % заменяли свежей. Первый пассаж проводили через 9 нед: содержимое чашки Петри переносили в 25 см флаконы («Costar»), содержащие 3 мл свежей среды. Первичные культуры и первые три пассажа проводили в среде, содержащей 50 мг/л гентамицина. После этого периода антибиотики не использовали. Последующие пассажи проводили с недельным интервалом: культуры центрифугировали (120 g, 5 мин) и клетки ресуспензировали в свежей среде в разведении 1 : 2 и 1 : 4. Линии клеток бабочек Spodoptera frugiperda и Plodia interpun-ctella имели различный характер роста. Клетки S. frugiperda (IAL-SFD1) растут в виде многоклеточных шаров и реагируют морфологически и биохимически на гормон насекомого (экдистерон). Напротив, клетки P. interpurictella растут в виде монослоя мелких веретеновидных клеток и не реагируют на гормон, хотя скорость их роста замедляется.
Дифференцировка целых имагинальных дисков в культуре зависит от многих факторов. В частности, необходимо присутствие в среде головных ганглиев [15] или гормона роста и дифференцировки — экдизона [38, 40, 41].
Слюнные железы. Культивирование слюнных желез Diptera представляет большой интерес для изучения, например, процессов пуффи-рования в политенных хромосомах [45—48]. Описаны простой метод и питательная среда С-50 химически определенного состава для культивирования слюнных желез дрозофилы [48].
Культивирование клеток насекомых
Первичные культуры. Для получения культур клеток яичников шелкопряда [23] их стерильно извлекают из гусениц, куколок или имаго, измельчают и диссоциируют на клетки с помощью 0.25 %-ного раствора трипсина «Difco», приготовленного на солевом растворе Грейса, в течение 15 мин при комнатной температуре. Полученную взвесь клеток суспензируют в питательной среде Грейса и инкубируют при 27—29 °С. После 48 ч инкубации большая часть клеток оседает на стекло. В течение первых 7 мес среду меняют через 7—14 сут, а после того как клетки начинают активно размножаться — через 4—5 сут.
