Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Определение концентрации КОКф в клеточных суспензиях и в исходных гемопоэтических органах по результатам культурального теста на КОКф. При правильной постановке культуральный тест на КОКф должен обеспечивать высокую эффективность клони-
рования, т. е. должен выявлять в виде образующихся колоний основную массу эксплантированных КОКф- Проверить, действительно ли ЭКОф в избранных условиях проведения теста является стабильной, можно следующим образом. После 2-часовой инкубации первично эксплантированных костномозговых клеток среда сливается, культуры промываются физраствором и заливаются на 3 мин 0.25 %-ным раствором трипсина. Затем трипсин сливается так, чтобы дно матраса оставалось влажным, и матрасы инкубируются при комнатной температуре в течение 20 мин. После этого матрасы заполняются культуральной средой без сыворотки, энергично встряхиваются, и среда вместе с открепившимися клетками переносится в свежий культуральный сосуд, добавляется до 20 % сыворотки и культуры инкубируются в термостате в течение 2 ч, после чего в них добавляется фидер. Культивирование таких матрасов продолжается в течение того же срока, что и матрасов, в которые была помещена та же исходная клеточная взвесь, но которые культивировались обычным способом, т. е. без трипсинизации и переноса клеток в новые культуральные сосуды. Сравнивая ЭКОф в таких контрольных культурах и в культурах клеток, открепленных и перенесенных в новые матрасы, можно судить о стабильности, с которой экспланти-рованные КОКф формируют колонии фибробластов в избранных условиях проведения теста.
ЭКОф, установленная в результате проведения культурального теста, дает возможность оценить, сколько КОКф содержалось в эксплантированной клеточной суспензии, и отсюда пересчитать, сколько их находится в кроветворном органе, клетки которого были подвергнуты эксплантации. Для этого нужно знать, какую часть содержащихся в соответствующем органе клеток использовали для культивирования (величина ЭКОф обратна концентрации
КОКф).
Как правило, ЭКОф для трипсинизированных клеток костного мозга мышей и морских свинок примерно в 10 раз выше, чем для механически дезагрегированных клеток (для клеток человека и кролика аналогичных данных нет), поскольку при трипсинизации костного мозга данных животных высвобождаются дополнительные КОКф. которые при механической дезагрегации повреждаются или остаются в составе клеточных агрегатов [16]. В связи с этим, оценивая содержание КОКф в костном мозге морских свинок и мышей, следует отдельно учитывать ЭКОф для трипсинизированных и механически дезагрегированных клеток.
Пассирование культуральных потомков КОКФ- Для получения поликлональных и клонированных штаммов костномозговых фибробластов используется пассирование фибробластов из первичных культур. Поликлональные штаммы получают путем пассирования всех колоний, выросших в первичной культуре, а клонированные штаммы — пассированием индивидуальных колоний. При пассировании определяют количество колоний, выросших в параллельных матрасах, которые для этого фиксируют и окрашивают. Пассированию подвергаются клетки, снимаемые трипсином. Нефиксированные
матрасы промываются физиологическим раствором для удаления сыворотки и обрабатываются трипсином в течение 20 мин. Затем матрасы заполняют культуральной средой без сыворотки, фибробласты отделяют от поверхности культуральных сосудов энергичным покачиванием, подвергают пипетированию, подсчитывают число снятых клеток и, добавив в среду сыворотку (10—20%), переносят в свежие матрасы для дальнейшего культивирования. В дальнейшем такие культуры ведут как обычные диплоидные штаммы фибробластов. Клонированные штаммы получают, пассируя колонии фибробластов по одной. Для этого используют исходные культуры, в которых колонии фибробластов располагаются на значительном расстоянии друг от друга. Обработку трипсином проводят в течение 5 мин, затем отдельные колонии снимают желатиновыми губками и губки вместе с клетками по одной переносят в новый культуральный сосуд, содержащий свежую культуральную среду с сывороткой. Клетки из губок вымывают пипетированием, после чего губки удаляют и проводят культивирование вымытых фибробластов.
Клетки первых двух пассажей могут иметь незначительную контаминацию макрофагами, но затем примесь макрофагов практически отсутствует. Успешному пассированию могут быть подвергнуты стромальные фибробласты людей, морских свинок и кроликов, но не мышей.
Проведение теста на КОКф может быть осуществлено с использованием сред отечественного производства, а также эмбриональной сыворотки коров, выпускаемой ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. В качестве культуральных сосудов мог]ут использоваться чашки Карреля и стеклянные матрасы отечественного производства. Применение чашек Петри и плейтов требует культивирования в СОг-инкубаторе. При культивировании в сосудах, закрываемых герметически, тест проводится в обычном термостате.
Литература
1. (Фриденштейн А. Я-, Чайлахян P. К-, Лалыкина К¦ С.) Fridenshtein A. Ja., Chailachan R. К-, Lalikina К¦ S. Development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells // Cell Tissue Kinet. 1970. Vol. 3. P. 393—403.
