Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Вахтин Ю.Б. -> "Методы культивирования клеток" -> 139

Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.

Вахтин Ю.Б., Соминина А.А. Методы культивирования клеток — Л.: Наука, 1988. — 313 c.
Скачать (прямая ссылка): metodikultivirovaniya1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 133 134 135 136 137 138 < 139 > 140 141 142 143 144 145 .. 171 >> Следующая

В то же время эксплантационная плотность не должна быть слишком малой, так так .нестромальные костномозговые клетки
оказывают на КОКф и их потомков фидерное действие, от которого зависит ЭКОф [13]. Для КОКф морских свинок, мышей и человека фидерное действие нестромальных костномозговых клеток выражается в увеличении ЭКОф. Это проявляется в том, что при повышении эксплантационной плотности ЭКОф возрастает. Максимальная ЭКОф достигается при эксплантационной плотности порядка 4 • 105 клеток на 1 ем2 для механически дезагрегированных и трипсинизированных костномозговых клеток. Однако при этом колонии сливаются между собой, поэтому столь высокая плотность не может применяться для теста на КОКф- Для достижения нужного фидерного эффекта приходится прибегать к эксплантации небольшого количества интактных костномозговых клеток, добавляя в культуру в качестве дополнительного фидера облученные костномозговые клетки, в которых КОКф инактивированы. Клетки облученного фидера создают, таким образом, нужный эффект плотности и оказывают фидерное действие на КОКф, находящиеся среди интактных костномозговых клеток. Инактивация КОКф фидерных клеток достигается рентгеновским облучением в дозе 60 Гр, которое сохраняет фидерную активность и ингибирует пролиферацию КОКф.
Фидерные клетки не обязательно должны быть гомологичны эксплантируемому интактному костному мозгу. Так, для КОКф человека могут быть использованы облученные костномозговые клетки крысы и кролика, а для КОКф мышей и морских свинок — облученные костномозговые клетки морской свинки [13, 14]. Добавление фидерных клеток повышает разрешающую способность теста на КОКф и стабилизирует его результаты. В присутствии дополнительного фидера обеспечивается четкая линейная зависимость количества колоний от числа эксплантируемых интактных костномозговых клеток и достигается возможность проводить тест на КОКф при эксплантации небольших количеств тестируемых клеток. Для механически дезагрегированных костномозговых клеток достаточно эксплантировать не более 3 • 105 костномозговых клеток на матрас независимо от его площади или не более 3 ¦ 104 клеток трипсинизированного костного мозга. Количество добавляемых фидерных клеток определяется площадью культурального сосуда и должно составлять около 4 • 105 на 1 см2 поверхности сосуда.1 Еще одно важное преимущество дополнительного фидера связано с тем, что в тех случаях, когда ЭКОф оказывается измененной, может возникнуть вопрос, зависит ли это от уменьшения количества КОКф в эксплантированной клеточной популяции или от изменения ее фидерной активности. В условиях добавления дополнительного фидера этот вопрос может быть снят. Для этого эксплантацию следует проводить в два этапа, как это будет указано ниже.
Эксплантация. Для определения ЭКОф исследуемую клеточную суспензию эксплантируют поровну в три одинаковых культуральных
1 В последнее время было показано, что вместо облученных костномозговых клеток в качестве дополнительного фидера может быть использовано двадцатикратное количество облученных тромбоцитов, выделенных из периферической крови человека, кролика или морской свинки [15].
сосуда. Меньшие колебания в числе колоний между отдельными культурами получаются, когда клетки, рассчитанные на все матрасы, разводят во всем объеме полной культуральной среды и затем эту среду вместе с клетками разливают по матрасам. Матрасы затем заполняют воздухом с добавлением 5 % СОг и помещают в термостат на 2 ч. За это время КОКф успевают прочно прикрепиться к поверхности культуральных сосудов. Затем неприкрепившиеся клетки сливают, сосуды промывают культуральной средой без сыворотки и добавляют нужное количество фидерных клеток в свежей полной среде. Дальнейшее культивирование проводят при 37 °С в течение 10—12 сут без смены среды. Через 8 сут от начала культивирования культуры следует проконтролировать в инвертированном микроскопе и в случае, если колонии достигли больших размеров, что может при дальнейшем культивировании привести к их слиянию или отделению от поверхности сосуда, культивирование следует закончить. За исключением указанного просмотра, перемещать (и в особенности переворачивать) сосуды в течение срока культивирования не рекомендуется.
Подсчет колоний. Для подсчета колоний культуры фиксируют, предварительно слив среду и промыв матрасы физиологическим раствором при комнатной температуре. Может быть использован любой гистологический фиксатор, например 80 %-ный этанол или формалин. Зафиксированные культуры могут быть окрашены любыми красителями (включая анилиновые и гематоксилин) или использованы для проведения гистохимических реакций. Следует иметь в ‘виду’ что для подсчета колоний удобнее заканчивать культивирование в момент, когда колонии еще не сливаются между собой, но имеют достаточную клеточную плотность и по возможности большие размеры. В качестве колонии учитываются все скопления фибробластов, имеющие в своем составе 50 и более клеток.
Подсчет колоний проводится после окраски с использованием бинокулярной лупы и обычно не вызывает затруднений. Исключение могут представлять культуры костного мозга мышей, в которых может наблюдаться пролиферация макрофагов и миелоидных клеток, контаминирующих колонии фибробластов. Трудности возникают из-за сходства, которое макрофаги и фибробласты приобретают в фиксированных культурах. Для точной их идентификации следует использовать гистохимическую реакцию на неспецифическую эсте-разу, ингибируемую фторидом натрия (положительная у макрофагов и отрицательная у фибробластов) или определение внутриклеточного коллагена I и III типов с помощью соответствующих антисывороток (I и III типы коллагена синтезируют фибробласты), а также выявление Fc- и С-рецепторов (имеются на поверхности макрофагов) с помощью реакции розеткообразования с эритроцитами, тонированными иммуноглобулином [3, 4].
Предыдущая << 1 .. 133 134 135 136 137 138 < 139 > 140 141 142 143 144 145 .. 171 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed