Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
6. Nitch J. P., Nitck C. Haploid plants from pollen grains // Science. 1969. Vol. 163, N 3862. P. 85—87.
7. Schenk R. U., Hildebrandl A. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Canad. J. Bot. 1972. Vol. 50. P. 199—204.
8. White Ph. R. The cultivation of animal and plant cells. New York, 1954. 239 p.
9. Чайлахян М. X., Бутенко P. Г., Кулаева О. H. и др. Терминология роста и развития высших растений. М., 1982. 54 с.
10. Фролова Л. В. Цитогенетическая изменчивость и автоселекция растительных клеток в условиях in vitro // Биотехнология. М., 1984. С. 272—277.
Культивирование клеток
и ткаией беспозвоночных
В. Т. Какпаков
Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова
АН СССР, Москва
В настоящее время известно около 120 пересеваемых линий клеток беспозвоночных; наибольшее число клеточных линий получены из насекомых [1]. Проблемы культивирования клеток и тканей беспозвоночных обсуждались на нескольких международных конференциях и на III Международном конгрессе по культуре клеток в г. Сендай (Япония) [2—5]. Однако культивирование клеток насекомых таит целый ряд нерешенных проблем. Интерес к культурам клеток и тканей насекомых связан с чрезвычайным разнообразием и оригинальностью роста и метаморфоза, которые могут быть прекрасным объектом для изучения основных процессов клеточной дифференци-ровки и регуляции активности генов в клетках высших организмов. Получение первичной и в особенности пересеваемой культуры клеток насекомых представляется сейчас чрезвычайно нелегким делом [6-13].
Среды для культивирования
Среды для культивирования клеток и тканей насекомых, предлагаемые разными авторами даже для одного вида, сильно варьируют по составу [14—18]. При составлении питательных сред часто руководствуются данными по составу гемолимфы. Однако ее состав часто изменчив у разных видов насекомых. В настоящее время предложено около 50 вариантов питательных сред для культивирования клеток беспозвоночных [18]. Все эти среды отличаются от сред для клеток и тканей млекопитающих наличием органических кислот, повышенным содержанием аминокислот и более высоким осмотическим давлением. Ни одна из этих сред не пригодна для получения культур клеток всех видов беспозвоночных [19, 20].
Фирма «GIBCO» (США) поставляет среды Чиу и Блэка [21] и Маркса М-14 и М-20 [22] для клеток клопов и кузнечиков; Грейса
[23] и Лейбовнп;i L-15 [24] для клеток шелкопрядов и комаров; Мит-сухаси [25] для клеток бабочек; Шнейдер [15] для клеток дрозофилы.
Нами предложена среда КШ-10 [26] для выращивания существующих линий клеток насекомых разных видов. Она приготавливается на дважды или трижды дистиллированной или деионизированной воде. Трудно растворимые компоненты среды, например тирозин и
триптофан, следует растворять отдельно. Соли магния и кальция добавляют в последнюю очередь, когда остальные компоненты уже растворены в основном объеме среды, после чего pH доводят до 6.8— 7.2. Приготовленную среду фильтруют через миллипоровый фильтр GS с диаметром пор 0.2 мкм, автоклавированный при 1 атм в течение 30 мин. Готовую среду можно хранить при 4 °С в течение года и больше. Очень часто среду обогащают добавлением эмбриональной сыворотки коров (2—10%), которую иногда можно полностью исключить [27].
Получение стерильных тканей насекомых
Стерильные внутренние органы достаточно крупных насекомых (например, бабочки) можно получить, если обработать их поверхность 70 %-ным спиртом в течение 10—15 мин и извлечь ткани в стерильных условиях [28]. Личинки и куколки насекомых, тщательно отмытые водой, стерилизуют 95 %-ным этанолом 10—15 мин. Однако при работе с мелкими насекомыми (например, дрозофила, домашняя муха или комар) сложно извлечь органы при сохранении их стерильности: приходится содержать насекомых в стерильных условиях. Методы получения стерильных культур насекомых различны и подробно описаны в ряде работ [19, 29, 30].
Стерилизацию эмбрионов (например, дрозофилы) проводят следующим образом. Яйца дрозофилы, отложенные в течение 1 —12 ч, собирают на лотках с кормом, содержащим убитые дрожжи. Смытые с корма ^йца переносят в капроновый мешочек, тщательно промывают водбпрозодной водой. Собранные яйца переносят в стакан, содержащий 30 %-ный раствор сахарозы, и оставляют на 1—24 ч в холодильнике. Плавающие эмбрионы осторожно переносят (переливают) в цилиндр с металлической сеткой (диаметр ячейки не более 500 мкм), через который проходят эмбрионы и мелкие частицы, а крупные кусочки корма и возможные личинки остаются. Затем эти эмбрионы переливают в другой цилиндр, содержащий металлическую сетку с диаметром пор не более 100 мкм, где задерживаются эмбрионы, а дрожжи и мелкие частицы смывают, пропуская через сетку около 0.5 л холодной водопроводной воды. Тщательно отмытые эмбрионы можно стерилизовать 70 %-ным этанолом 5—10 мин и 95 %-ным этанолом 10—20 мин. После отмывания эмбрионов стерильным солевым раствором или средой можно получить массу клеток для первичного культивирования и выделения пересеваемых линий клеток [31, 32]. Если перенести такие стерильные эмбрионы на i стерильный корм, то можно получить безмикробные (аксеНные) ^культуры насекомых [19].
