Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
водой, затем ополаскивают дистиллированной водой, закрывают крышками и заворачивают в пакетики по fb--8 штук;: стерилизация производится облучением в 30 кГ'р. Обработка культуральной посуды (мытье и стерилизация) производится согласно общим правилам культуральной работы.
Причины неудач при культивировании фибробластов человека. Наиболее частой причиной неудач являются бактериальные и грибковые проросты и поражение микоплазмой. Необходимо иметь минимальную микробиологическую службу в каждой* культуральной лаборатории (питательный агар и бульон, красители для идентификации микробов). Соблюдение правил стерильной работы предотвращает возможность инфицирования. По нашим наблюдениям, наиболее часто культуры утрачиваются после снятия клеток с нокров-ных стекол, что связано либо с неполным снятием клеток, с преждевременным их снятием, а также с тем, что клетки сразу помещаются в слишком большой объем среды. Важно помнить, что нормальные (нетрансформированные) фибробласты плохо размножаются в условиях редкого посева. Начинающему,' исследователю лучше упражняться в культивировании, используя абортивный материал.
JlHxepatypa
1. Breakfietd X. О., Pintar J Е. The use of cell culture to analyze the genetic basis of human neurologic disease//Genetic research strategies in psychobiology and psychiatry. Amsterdam, S981. P. 407 —414,.
2. Neurofibromatosis (von Recklinghausen disease): Genet’. «11 biology and biochemistry//Adv. Neurol, New York, 1981. Vol. 29. 304 p.
3. Neufetd E. F. Contribution of ceil culture to studies of. lysosomal enzymes//
Excerpta medica. Intern, Congr. Ser. (Mexico). 1976. N 397. P., H!
4. Dowson G., Matalon R;,. Dorfman A. GlycoSDhingolipids in cultured human
skin fibroblasts//J. Biol. Chem. 1972. Vol 247.'P. 5951—5958.
5. Nadler H. L. Antenatal detection of hereditary disorders // Pediatrics. 1968.
Vol. 42. P. 912—918.
6. Bearn A. Cell culture in inherited disease with some notes- on genetic heterogeneity // New Engl. J. Med. 1972, Vol. 286. P. 764—767.
7. Horwitz A. L. Genetic complementation studies of multiple sulfatase deficiency// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 71. P. 6496з~'о499.
8. McKusick V. The growth and' development of' Human genetics as a clinical
discipline//Amer. J, Hum. Genet. 1975. Vol. 27, N3. P. 261—273,
9. Гринберг К. H. Цитологические проявления хромосомного диабаланса у человека // Прогресс в медицинской генетике. М., 1978. С. 151—186.
10. Shannon Danes В. The humble fibroblast—a curiosity or a ceil model /or human genetic research //Clin. Genet Ш85. Vol. 28, N6, P. 563—566.
Клонирование стромальных клеток-предшественникаа А. Я. Фриде н.ицт.е й н Институт эпидемиологии
и. микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР, Москва
Культуральный тест на клоногенные стромальные клетки кроветворной ткани разработан в ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР в 1970 г. и проводится в монослойвш» культурах костного
мозга и лимфоидных органов. При низкой эксплантационной плотности в таких культурах образуются стромальные колонии, которые растут на поверхности культуральных сосудов. Колонии состоят из фибробластов, синтезирующих интерстициальные коллагены
I и III типов и фибронектин и лишенных антигена VIII фактора и Fc- и С-рецепторов. Все эти признаки отличают клетки стромальных колоний от других адгезивных клеток костного мозга и лимфоидных органов, в частности, от клеток эндотелия и от макрофагов [1—4].
По количеству колоний можно судить о численности стромальных колониеобразующих единиц (КОЕф, CFUf) или, что то же, о численности стромальных клоногенных клеток (КОКф, FCFC), так как стромальные колонии являются клеточными клонами [2, 4—6]. КОКф имеют высокие пролиферативные потенции, но in situ они практически не пролиферируют. После эксплантации КОКф и их потомки вступают в пролиферацию и проделывают в культурах более 25 клеточных удвоений, сохраняя диплоидный набор хромосом. В результате могут быть получены диплоидные стромальные штаммы фибробластов — поликлональные, когда штаммы состоят из потомков нескольких КОКф, и клонированные, которые получают пассированием индивидуальных стромальных колоний [7, 8]. Дифференцировочные потенции КОКф и их роль в кроветворении и лимфопоэзе выявились в экспериментах по обратной трансплантации в организм стромальных штаммов, предварительно выращенные в культурах. И поликлональные, и клонированные стромальные штаммы образуют при гегеротопной трансплантации все типы механоцитов, которые характерны для того кроветворного органа, из которой были выделены исходные КОКф. Так, при трансплантации в организм стромальных штаммов, предварительно выращенных в культурах. И поликлональные, и клонированные стромаль-щевые клетки, а поликлональные штаммы селезеночных фибробластов — только ретикулярные клетки [9, 10]. Трансплантация стромальных штаммов в открытых для клеток системах приводит к формированию гетеротопных кроветворных органов, строму которых образуют пересаженные фибробласты. Такие органы путем репопуляции заселяются гемопоэтическими или лимфоидными клетками, и в результате в случае трансплантации культуральных потомков костномозговых КОКф формируются костные органы с медуллярной полостью, заселенной костным мозгом, а при трансплантации культуральных потомков селезеночных КОКф — лимфоидные органы, заселенные лимфоцитами [11, 12]. Эти результаты доказывают, что КОКф являются стволовыми стромальными клетками — переносчиками гемопоэтических микроокружений и что костномозговые КОКф одновременно служат стволовыми остеогенными клетками [10].
