Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Контроль штаммов. Существует много методов для осуществления контроля качества клеток. В этом разделе мы укажем лишь на самые простые приемы, которые могут и должны использоваться в ходе рутинного размножения клеток. Необходим ежеднев-
ный просмотр культуральных сосудов для оценки цвета среды и ее прозрачности. Резкое изменение цвета и появление мути может свидетельствовать о бактериальном или грибковом заражении. Если цвет индикатора среды не изменяется после пересева или сдвигается в сторону малинового, то это может быть связано с отсутствием размножения клеток, с недостаточным их количеством для данного объема или с их гибелью.
При помощи инвертированного микроскопа необходимо 1—2 раза в неделю просматривать культуры, оценивая морфологию клеток и слоя в целом. Фибробласты в норме обладают ориентированным ростом и поэтому образуют характерный рисунок на субстрате. В нормальных условиях фибробласты — веретенообразные вытянутые клетки с прозрачной цитоплазмой. Отсутствие рисунка, распла-станность клеток, появление зернистости в цитоплазме, пустые места в слое клеток свидетельствуют об их дегенерации вследствие токсических или иных вредных влияний. Необходимо после каждого пересева отливать в стерильный пенициллиновый флакон небольшое количество среды и сыворотки для проверки отдельных компонентов питательной среды на стерильность. При подозрении на бактериальный пророст следует производить посев питательной среды и ее компонентов на агар. Во избежание потери штамма в результате бактериальной или иной инфекции не следует пересевать сразу все культуральные сосуды (оставить небольшое количество культуры для «подстраховки»).
Криоконсервация. В случае успешного культивирования выведенные клеточные штаммы подвергают криоконсервации (глубокому замораживанию) на ранних пассажах. Запас замороженных клеток дает возможность проводить дополнительные исследования на тех же самых штаммах практически в любое удобное для исследователя время и избавляет от больших потерь времени и средств для поддержания жизни штаммов.
За сутки до криоконсервации меняют среду в культуральном сосуде. Клетки снимают с субстрата при помощи трипсина, как было описано выше. В подготовленную для замораживания клеточную суспензию (1.5—2.0 млн./мл) вводят диметилсульфоксид в количестве 5—10 % от общего объема суспензии или стерильный глицерин (до 10%), тщательно перемешивая. Полученную смесь разливают по 1 мл в пластмассовые ампулы. Верхнюю часть ампулы с плотно притертой крышкой заклеивают лейкопластырем, иа котором надписывают номер штамма и пассаж. Ампулы помещают в программный аппарат для замораживания клеток, в котором клеточная суспензия охлаждается со скоростью 1 °С/мин до —70 °С. После этого ампулы переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом. При отсутствии аппарата для замораживания снижение температуры до указанной можно производить вручную при помощи охлаждающей смеси — любой этиловый спирт или ацетон, в который добавляют небольшими порциями твердую углекислоту (сухой лед), следя за показаниями термометра. Размораживают клетки быстрым извлече-
нием ампул из жидкого азота с последующим помещением их в водяную баню с температурой воды 41 °С (на 2 мин). Клеточную суспензию из одной ампулы переносят в небольшой флакон Карреля с добавлением около 5 мл питательной среды. Успешность деконсервации определяют на 2-е сутки, когда на дне сосуда под малым увеличением микроскопа видны живые распластанные клетки.
Питательные среды. Для культивирования фибробластов используют среду Игла в различных модификациях и сыворотку (крупного рогатого скота, теленка, эмбриона коровы). Вообще фибробласты успешно культивируют и на других средах, однако во всем мире принято для диагностических целей использовать только среду Игла. Мы рекомендуем следующий состав питательной среды: 1) среда Игла (Институт полиомиэлита и вирусных энцефалитов АМН СССР) — 90—85 %; 2) сыворотка крупного рогатого скота (Московский мясокомбинат им. А. И. Микояна) — 5—10 %; 3) пуповинная сыворотка человека — 5 %; 4) глютамин — 150 мг на 500 мл готовой среды. Готовую питательную среду и ее компоненты следует хранить при 4 °С.
Приготовление пуповинной сыворотки. Кровь собирают в родильном отделении. Заранее приготовленные стерильные флаконы из-под среды подставляют под отрезанный конец пуповины (до рождения плаценты). Собранную кровь хранят в холодильнике. После образования сгустка сыворотку сливают в центрифужные стаканы и центрифугируют при 500 g 2 раза по 20 мин. Затем сыворотку осветляют путем фильтрации через мембранные фильтры («Сынпор», «МПНроге») с диаметром пор 0.85 мкм, затем 0.4, 0.3 и 0.22 мкм. ‘Последняя фильтрация — стерилизующая, производится в стерильных условиях. Полученную сыворотку проверяют на стерильность посевом на агар.
При ведении штаммов антибиотики применять не рекомендуется. Их необходимо исиользовать при культивировании эксплантатов (канамицин 40—60 мкг на 1 мл среды), а также добавлять в среду с биоптатом.
Культуральная посуда и оборудование: пипетки мерные от 1 до 10 мл; пипетки Пастера; сосуды Карреля (сосуды Коля) всех размеров; пенициллиновые флаконы; пробирки Лейтона; мерные флаконы от среды разных объемов; пробки резиновые № 10, 12.5, 14.5, 24; стекла покровные для микроскопии, предварительно нарезанные для помещения их в пенициллиновые флаконы или в пробирки Лейтона; пинцеты глазные анатомические и хурургические; зажим Кохера; бритва безопасная, препаровальная игла из нержавеющей стали (может использоваться зубоврачебный зонд); резиновая груша с надетой на нее резиновой трубкой для работы с пипетками; микроскоп инвертированный; ламинар-бокс или стерильный бокс; термостат с водяной рубашкой и термостат с углекислым газом (газопроточный инкубатор Г’ПИ-01 или самодельные устройства); центрифуга для больших объемов жидкости; ампулы пластмассовые объемом 1.5 см3; ампулы перед употреблением сугки вымачивают в теплой мыльной воде, моют ершиком, сутки промывают проточной
