Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Смену среды (на ‘/г) можно осуществлять дважды в неделю, что не сказывается на продолжительности кроветворения; более частые смены отрицательно влияют на гемопоэз, приводя к истощению попу- “ ляции СКК [И]. Даже если среду еженедельно менять полностью, удаляя все неприкрепляющиеся клетки, СКК образуются и поддерживаются в течение нескольких месяцев [18].
Рассмотрим другие параметры декстеровской системы. Культуральная среда содержит 20—25 % сыворотки и антибиотики (как правило, пенициллин и стрептомицин — по 100 ед/мл). Тип применяемой среды не является критическим. Помимо среды Фишера, используемой в большей части работ, успешно применяются среда Игла в модификации Дальбекко (ДМЕМ) [10, 16] и альфа-модификации, среда Мак-Коя 5А [7]. Для разведения сухих сред следует пользоваться тридистиллированной водой; сразу после разведения среду стерилизуют фильтрацией через миллипоровый фильтр с диаметром пор С.45 мкм или (лучше) 0.22 мкм. Напротив, тип сыворотки играет решающую роль. Первоначально было показано, что длительный гемопоэз происходит только при использовании некоторых партий лошадиной сыворотки («Flow»); все прочие сыворотки оказываются неспособными к поддержанию кроветворения in vitro [И, 14, 15, 19]. Однако в дальнейшем оказалось, что добавление в культуры Ю-10—10“б М гидрокортизона (гемисукцинат натрия) приводит к тому, что 12 из 16 «неэффективных» партий лошадиной сыворотки, а также часть партий эмбриональной сыворотки коров и коз приобретают способность длительно поддерживать гемопоэз. Некоторые
другие кортикостероиды и минералкортикоиды также эффективны в этом отношении [19].
Наш собственный опыт в отношении сыворотки состоит в том, что ни одна из доступных лошадиных сывороток (в том* числе и после разрушения комплемента нагреванием'при 56 °С) не-способствовала развитию адекватной адгезивной подложки и поддержанию гемо-поэза. Напротив, часть партий эмбриональной сыворотки коров (производства ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи) при условии добавления в культуры 10-7 М гидрокортизона оказалась вполне удовлетворительной.
Газовая фаза декстеровских культур состоит из смеси воздуха с 5 % (или 7.5 %) С02. Оптимальная температура не 37 °С (температура, обычно применяемая для культивирования тканей теплокровных животных), а 33 °С — при этой температуре плотность культур и количество СКК в несколько раз выше, а адгезивный слой развивается лучше [14, 19]. При 37 °С также удается воспроизвести систему с длительным поддержанием кроветворения [10].
При соблюдении рассмотренных выше условий в культурах длительно, в течение 9—18 нед, поддерживаются линия СКК и морфологически различимый гемопоэз [9, 12, 14, 17, 18, 20].
Декстеровские культуры костного мозга человека. Получение декстеровских культур костного мозга человека сопряжено с большими трудностями, чем для мышиного костного мозга, хотя принципы культивирования остаются по существу теми же. Костный мозг получают путем пункции или биопсии подвздошной кости [17, 21 — 23], либо хирургически из ребер нормальных доноров [21, 22, 24, 25]. Эксплантируют либо фрагменты, не разбивая их до состояния клеточной суспензии [18, 23, 26], либо суспензию дезагрегированных костномозговых клеток в количестве 5-> • 106—2 • 107 клеток на стандартный матрас [24, 25]. Существуют данные, что при эксплантации суспензий культуры развиваются успешнее [21]. После образования адгезивного слоя на него подсаживают 1 • Ш7 клеток сингенного [17, 23] или (0.5—1) • 10* клеток аллогенного костного мозга [24, 25], либо клетки костного мозга вообще не добавляют [21, 26]. Используют культуральные среды разного состава: среду Фишера с 20 % лошадиной сыворотки [17, 24—26], среду Игла в альфа-модификации с той же сывороткой [23], среду Фишера с эмбриональной сывороткой коров [24, 25], среду Мак-Коя 5А с 12.5% лошадиной и 12.5% эмбриональной сыворотки коров [21, 22]. Как и в мышиных культурах, весьма положительный эффект оказывает добавление 10^6—10-7 М гидрокортизона [21, 24—26]. Для культур костного мозга человека температура 37 °С предпочтительнее,,чем 33 °С [17, 23, 26], либо разницы между культурами при обеих температурах не обнаруживается [25].
В растущих культурах поддерживаются линия коммитированных клеток — предшественников гранулоцитов и макрофагов — КОЕ-К (т. е., вероятно, и линия полипотентных СКК) и морфологически различимый гемопоэз. Сроки поддержания кроветворения лишь в некоторых работах приближаются к 20 нед [21, 22], а в большинстве
случаев ограничиваются 7—9 нед [17, 23—26], что существенно уступает продолжительности гемопоэза в мышиных культурах. Причину этого связывают с тем, 4jto в значительной части культур клеток человека наблюдается преждевременное сокращение и открепление адгезивной подложки, причем гемопоэз падает пропорционально степени ее потери [17, 23, 25]. Величина открепления обратно пропорциональна концентрации гщдрокортизона (в пределах 10-8— 10-5 М), но высокие его дозы шнгибируют образование КОЕ-К
[24].
I Характеристики кроветвореиия и лимфюпоэза '
