Методы культивирования клеток - Вахтин Ю.Б.
Скачать (прямая ссылка):
В последние годы на основе декстеровских культур разработана система культивирования, позволяющая в присутствии стромального подслоя получить длительную пролиферацию и дифференцировку лимфоидных клеток мыши.
< *
Приготовление декстеровских культур
Декстеровские культуры костного мозга мыши. В своем «классическом» виде методика состоит из, двух этапов: получения адгезивного слоя и вторичной подсадки костномозговых клеток. Пригодны мыши почти всех линий, исключение составляют животные генотипа Н-2К (линии СЗН и в ряде случаев СВА), костномозговые клетки которых образуют адгезивный сло:й, но не годятся для вторичной подсадки [8—10]. Пол мышей, по-вадимому, не играет существенной роли; предпочтительно брать косгный мозг молодых и здоровых животных.
Первоначально для культивирования употребляли плоскодонные стеклянные сосуды, затем было токазано, что вполне пригодны стандартные пластиковые матрасы ((«Falcon», «Corning» и др.) с площадью дна 25 см2. Такие матрасы, как правило, являются одноразовыми; в случае повторного использования их стерилизуют у-облуче-
Для установления адгезивного слоя в культуральный сосуд, содержащий 10 мл (можно 7—8 мл) среды, выдувают содержимое одной бедренной кости. Кость только что убитого животного очищают от мышц, отрезают оба эпифиза и в медуллярную полость вставляют надетую на шприц (5 мл) иглу, по своему диаметру соответствующую костномозговому каналу. Средой, содержащейся в шприце, костный мозг выдувают прямо в матрас. Этот момент — один из самых принципиальных, поскольку костный мозг следует выдуть таким образом, чтобы он имел вид мелких фрагментов. Авторы методики не указывают, каким образом им удалось стандартизировать процедуру выдувания. Мы добивались нужного результата одним из двух приемов: можно научиться обрезать противоположный игле эпифиз так, что остается тонкая пластинка губчатой кости, служащая как бы решетом, либо (что проще), вставив иглу, сначала набрать часть костного мозга в шприц, а затем выдуть все содержимое шприца через костномозговую полость в матрас.
Показано, что при выдувании костного мозга в виде мелких фрагментов установление адгезивного слоя и последующее кроветворение на нем протекают успешнее, чем в культурах, куда эксплантируют суспензию дезагрегированных костномозговых клеток [8, 11, 12]. Однако удовлетворительные культуры получают и в тех случаях, когда в матрас помещают клеточную суспензию костного мозга в количестве 1 • 107 клеток, что приблизительно соответствует содержимому одной бедренной кости [13—15], либо 5 • 10®—5 • 107 клеток [10, 16]. Нам удавалось получить образование адгезивного слоя, поддерживающего кроветворение, при эксплантации суспензии клеток, полученной путем обработки костного мозга 0.25 %-иым раствором трипсина (30 мин на магнитной мешалке в силиконизированной посуде при комнатной температуре). После ферментативного воздействия в сосуд добавляли 2 % сыворотки, ресуспензировали клетки при 4 °С многократным пипетированием пастеровской пипеткой, фильтровали через 4-слойный капроновый фильтр (для удаления клеточных агрегатов), центрифугировали (10 мин, 900 об/мин), осадок ресуспензировали в свежей среде и помещали по 1 • 107 ядерных клеток в матрас.
При любом из этих способов эксплантации показателем успешного культивирования служит образование многослойного пласта адгезивных клеток, покрывающего дно сосуда (следует подчеркнуть, что наблюдение за развитием адгезивной подложки желательно вести с помощью инвертированного микроскопа, не переворачивая матрас). По-видимому, независимо от способа эксплантации, необходимо прежде всего образование сплошного адгезивного слоя: при низкой плотности клеток в слое гемопоэз осуществляется хуже [10].
Через 3 иед, когда все дно матраса оказывается покрытым адгезивным слоем, а количество неприкрепляющихся клеток и СКК сильно падает, среду с плавающими клетками удаляют и на ее место поверх адгезивного слоя помещают в 10 мл свежей среды суспензию клеток сиигенного свежеизолированного костного мозга (по 1 • 107 клеток на матрас). В дальнейшем '/г среды меняют еженедельно, как
и в течение первых 3 нед, предшествующих вторичной подсадке. Процедуру вторичной подсадки и смены среды следует производить с осторожностью, чтобы не вызвать открепления адгезивного слоя. Поскольку декстеровские культуры являются весьма длительными, особое внимание должно быть уделено стерильности, чтобы избежать грибкового или бактериального заражения культур. С этой целью необходимо обеспечить горизонтальное положение матрасов в термостате, что позволяет сохранять сухими горлышко и пробку.
В некоторых случаях продолжительное кроветворение удается получить, осуществляя вторичную подсадку (3—5) • 10б костномозговых клеток уже через 1 нед после первичной эксплантации. Эти клетки не обязательно должны быть сингенны адгезивному слою: размножаться могут и аллогенные [8—10], но не ксеногенные [17] гемопоэтические клетки. Адгезивный костномозговой слой поддерживает пролиферацию эмбриональных мышиных кроветворных клеток, полученных из печени либо желточного мешка [9]. Наконец, длительное кроветворение может протекать вообще без вторичной подсадки: при этом количество клеток неадгезивной фракции первоначально резко падает, а с 3-й недели снова начинает возрастать. Вероятно, при некоторых условиях культивирования часть первоначально введенных СКК может доживать до того периода, когда устанавливается адекватная стромальная подложка, и давать начало последующему кроветворению.
