Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Локализацию белков, обладающих ферментативной активностью, можно определить косвенным путем. Для этого гель помещают в раствор субстрата данного фермента, и, если продукт реакции окрашен, сразу выявляется его местоположение, а следовательно, и местоположение фермента.
Местоположение радиоактивных веществ можно обнаружить методом авторадиографии или с помощью прибора для сканирования радиохроматограмм. Носитель можно также разрезать на маленькие кусочки, поместить их в соответствующий сцинтиллятор и определить радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика.
4.4. Специальные электрофоретические методы
4.4.1. Высоковольтный электрофорез
При разделении низкомолекулярных веществ с помощью низкот вольтного электрофореза на бумаге наблюдается значительная диффузия. Это нежелательное явление можно исключить, если , приме-
128 Часть II. Методы разделения
Рис. 4.4. Система полного погружения при высоковольтном электрофорезе,
I — электрод; 2 — изолированная крышка; 3 — змеевик; 4 — буфер; 5 — лист бумаги, 6 —
буфер.
нять значительно более высокие напряжения; при этом улучшается разрешение, а разделение происходит очень быстро, за 10—60 мин. Для этой цели используют источники питания, обеспечивающие напряжение до 10 ООО В, силу тока до 500 мА и создающие градиент потенциала до 200 В-см-1.
При высоковольтном электрофорезе выделяется такое большое количество тепла, что требуется эффективная система охлаждения. Охлаждение можно осуществлять двумя способами — «полным погружением» и с помощью охлаждающих пластин.
При «полном погружении» (рис. 4.4) насыщенную буфером бумагу с нанесенным образцом погружают в большой объем охлаждающей жидкости, которая действует как жидкий теплообменник, отводя от бумаги тепло. Охлаждающая жидкость должна быть электрически инертной и не смешиваться ни с буфером, ни с образцами. Для этих целей широко применяются органические растворители, например толуол или варсол (уайт-спирт). Обычно в охлаждающую жидкость погружают змеевик, по которому циркулирует вода,, что обеспечивает дополнительное охлаждение. Метод «полного погружения» достаточно эффективен и технически легко осуществим, однако охлаждающие жидкости, как правило, токсичны и легко-воспламеняемы.
Система охлаждающих пластин безопаснее и более эффективна (рис. 4.5). Две пластины (как правило, алюминиевые) плотно, под
Гл. 4. Электрофорез 129
Рис. 4.5. Система с охлаждающими пластинами при высоковольтном электрофорезе.
1 — изолированная крышка; 2 — прижимающая прокладка; 3 — охлаждающие пластины; 4 — политеи; 5 — электрод; 6 — буфер; 7 — фитиль-мостик; 8 — лист бумаги; 9 — охлаждающая жидкость (вода).
давлением прижимаются надувной прокладкой к изолированному от них политеном носителю. Размеры пластин доходят до 50 x 50 см, поэтому разделение можно проводить на листах бумаги большого формата (обычно ватман 3ММ). В охлаждающих пластинах имеются каналы для циркуляции воды. При использовании больших пластин расход воды должен составлять от 10 до 15 дм3-мин'1. В жарких странах воду необходимо предварительно охлаждать. Если вода очень жесткая, рекомендуется добавлять в нее умягчитель, чтобы1 предотвратить образование осадка в каналах пластин. Нужно еле* дить за тем, чтобы на пластинах не возникало температурных градиентов, так как различие в Г С вызывает изменение скорости миграции на 3%, а это сказывается на воспроизводимости результатов. Исключительно важно, чтобы все оборудование было полностью электрически изолировано, поскольку применяемые напряжения смертельны. Необходимо строго соблюдать обычные меры предосторожности, несмотря на то что фирменные приборы, как правило* снабжены для предотвращения несчастных случаев рядом предохранительных отключающих устройств.
При исследовании белковых гидролизатов часто после высоковольтного электрофореза проводят хроматографию в перпендикулярном направлении. В этом случае, как и при двухмерном тонкослойном электрофорезе (разд. 4.3.2), получаются характерные для различных белков «отпечатки пальцев».
4.4.2. Непрерывный (проточный) электрофорез
Проточный электрофорез — это разновидность низковольтного электрофореза на бумаге. Образец, растворенный или суспендированный в буфере, непрерывно наносят в верхней части вертикально расположенного листа бумаги. Образец увлекается вниз буфером, стекающим под действием силы тяжести, одновременно с этим
130 Часть II. Методы разделения I
Рис. 4.6. Прибор для непрерывного (проточного) электрофореза.
I — сосуд с буферным раствором; 5 —устройство для нанесения образца; 5 —лист бумаги; 4 — электрод; Б — пробирки коллектора.
заряженные компоненты образца под влиянием электрического поля перемещаются в горизонтальном направлении (рис. 4.6). Аппарат помещают в камеру из плексигласа. Падение напряжения на бумаге составляет до 500 В, скорость нанесения образца равна приблизительно 0,2 см^ч-1.
Стационарность потока буфера обеспечивается тем, что буферный раствор в сосуде поддерживается на постоянном уровне. Разделившиеся вещества собирают в пробирки, расположенные под нижним зубчатым краем листа бумаги. Разделение продолжается до 2 сут. Оптимального разделения в каждом частном случае добиваются путем эмпирического подбора места нанесения образца, скорости движения буфера и образца, а также применяемого напряжения.
