Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Когда замыкающие глицинатные ионы доходят до рабочего геля, их число и подвижность увеличиваются, поскольку значение pH 8,9 приближается к рКа, глицина. Теперь подвижность глицинатных ионов становится выше, чем у белковых анионов. Глицинатные ионы «подтягиваются», при этом образуется более резкая граница между ними и ионами хлора. С белковыми анионами такого не происходит, поскольку молекулярное сито при переходе от верхнего геля к рабочему становится более мелким. Как только последний ион хлора уходит из рабочего геля, pH повышается, потому что ионы хлора заменяются более основными глицинатными, и вместо исходной системы трис-HCl образуется трис-глициновый буфер. Вследствие этого возрастает отрицательный заряд белковых анионов, и их движение в однородном электрическом поле происходит в соответствии с величинами отношения заряд/масса» Электрофорез обычно завершается в пределах 1 ч при постоянной силе тока 10 мА на одну рабочую трубочку.
4.4.4. Иммуноэлектрофорез
Этот метод, сочетающий электрофорез с иммунодиффузией, дает возможность различить сходные по электрофоретической подвижности вещества с помощью специфической реакции преципитации между антигеном и соответствующим антителом. Метод особенно ценен для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях, например антигенов иммуноглобулинов. Принцип, лежащий в основе иммуноэлектрофореза, наглядно представлен на рис. 4.9.
Первоначально смесь антигенов разделяют с помощью электрофореза на тонкой агаровой пластинке. Затем в желобок, вырезанный в агаре, вносят смесь антител. Смесь диффундирует через
134 Часть II. Методы разделения
/
3
I. Разделение антигенов с псмошью электрофореза в течение 90, мин при 10 Б ем '
4
II Диффузия и преципитация е течение 16-24 н
Рис. 4.9. Разделение с помощью иммуноэлектрофореза.
t — 2%-иый (весовые проценты) агар на стеклянной пластинке; 2 — смесь антигенов; S — мостик-фитиль нз фильтровальной бумаги, погружаемый в электродную камеру; 4 — антиген, диффундирующий радиально от места ианесения; 5 —дуга преципитации вдоль лиии» максимальной концентрации; 6 — желобок, в который помещают смесь антител, диффундирующих перпендикулярно направлению, в котором производился электрофорез.
пластинку латерально, и в то же самое время происходит радиальная диффузия антигенных компонентов от мест их локализации в агаре. При встрече антигена с соответствующим антителом происходит преципитация в форме дуги.. Количество образовавшихся дуг соответствует числу антигенов. Предпочтительнее проводить иммуноэлектрофорез на агаре, однако можно использовать также'ацетат целлюлозы, крахмальный и полиакриламидный гели.
4.4.5. Изоэлектрическое фокусирование
В основе этого метода лежит фронтальный, а не зональный электрофорез (разд. 4.1). Амфотерные вещества, такие, как аминокислоты и пептиды, разделяют на специально предназначенной для этого вертикальной колонке одновременно в градиенте как pH, так и напряжения. Каждое вещество движется к той части колонки, где значение pH соответствует его изоэлектрической точке, и там останавливается (фокусируется)*
Гл. 4. Электрофорез 13Б
Метод состоит в следующем. Вертикальную стеклянную колонку заполняют смесью имеющихся в продаже синтетических низкомолекулярных амфолитов-носителей, индивидуальные изоэлектриче-•ские точки которых имеют значения, перекрывающие предварительно выбранную область pH. Амфолиты обычно суспендируют в растворе сахарозы, чтобы среда была плотной и в ней отсутствовали конвекционные потоки. Верхний конец колонки (анод) соединен с •сосудом, содержащим сильнокислый раствор (например, фосфорную кислоту), а нижний (катод) — с сосудом, содержащим сильно-дцелочной раствор (например, этаноламин). При открытии клапанов :в сосудах эти растворы начинают диффундировать в колонку каждый со своего конца, и через некоторое время в колонке устанавливается градиент pH с крайними значениями, соответствующими pH кислого и щелочного растворов. После этого клапаны закрывают и включают ток. Амфолиты в растворе мигрируют до тех пор, пока не достигнут области pH, при которой их суммарный заряд равен нулю. Здесь они прекращают движение, стабилизируя тем самым исходный градиент pH. Затем, открыв кран, вводят в верхнюю часть колонки образец. Разделение продолжается от 1 до 3 сут; за это время компоненты смеси распределяются по зонам со значениями pH, соответствующими их изоэлектрическим точкам. По завершении разделения выключают ток и фракции, поступающие через кран в нижней части колонки, собирают в пробирки коллектора для последующего анализа.
Изоэлектрическое фокусирование оказалось весьма полезным методом для разделения, очистки и идентификации белков за один прием. Очень высокая разрешающая способность метода делает •его особенно ценным для идентификации изоферментов: для разделения достаточно различий в изоэлектрических точках всего в 0,02 единицы pH.
Гель-электрофокусирование является модификацией изоэлект-рического фокусирования и применяется преимущественно для микроанализа белков. Сахарозную среду заменяют полиакриламидным гелем, а разделение занимает всего 1—3 ч.
