Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Уильямс Б. -> "Методы практической биохимии" -> 47

Методы практической биохимии - Уильямс Б.

Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии — М.: Мир, 1978. — 273 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiprakticheskoybiohimii1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 112 >> Следующая

4.2.1. Образец
Электрофоретическая подвижность заряженных молекул зависит от нескольких факторов.
Заряд. Подвижность возрастает с увеличением суммарного заряда. Величина заряда обычно зависит от pH.
Размеры. Чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность; это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой по срэвненик> с молекулами меньших размеров.
Форма. Молекулы одинакового размера, но различной формы,, например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разной подвижностью; это обусловлено различиями в силе трения и электростатическом взаимодействии.
4.2.2. Электрическое поле
Согласно закону Ома, сила тока I (в амперах), напряжение V (в вольтах) и сопротивление R (в омах) связаны следующим соотношением: I = V/R. На разделение ионов в электрическом поле влияют все три фактора.
Сила тока. Поскольку ток в растворе между электродами обусловлен исключительно переносом ионов буфера и образца, скорость их перемещения прямо пропорциональна силе тока. Длина пути, пройденного ионами, будет пропорциональна времени пропускания тока. Следовательно, для максимальной воспроизводимости результатов сила тока в процессе электролиза не должна меняться. Само собой разумеется, что ток должен быть постоянным.
Напряжение. Оно связано с силой тока приведенным выше соотношением; отсюда следует, что скорость миграции пропорциональна падению напряжения в поддерживающей среде, или градиенту напряжения, обычно выражаемому в В-см-1 (приложенное напряжение, деленное на длину слоя носителя). Используются как низкие (100—500 В), так и высокие (500—10 000 В) напряжения с градиентами до 20 и 200 В-см-1 соответственно. По причинам, которые будут разъяснены позднее (разд. 4.1.1), высокие напряжения применяют в основном для разделения низкомолекулярных веще ств.
Сопротивление. Скорость миграции обратно пропорциональна сопротивлению, которое в свою очередь зависит от типа и размеров, носителя и от ионной силы буфера. Сопротивление возрастает с увеличением длины слоя носителя и уменьшается при увеличении его ширины, а также с возрастанием концентрации буферных ионов.
Гл. 4. Электрофорез 117
В ходе электрофореза выделяется тепло, количество которого в единицу времени равно I2R Вт, при этом сопротивление уменьшается. Следовательно, при постоянном напряжении такое нагревание приведет к увеличению силы тока и усиленному испарению растворителя. Для обеспечения максимальной воспроизводимости результатов применяют стабилизированные источники питания, которые автоматически поддерживают на постоянном уровне либо напряжение, либо силу тока, несмотря на неизбежные при температурных флуктуациях изменения сопротивления. Испарение сводят до минимума, помещая аппарат под воздухонепроницаемую крышку. Для дополнительного охлаждения при работе с высоким напряжением в аппарат встраивается охлаждающая система.
4.2.3. Буфер
Буфер создает и стабилизирует pH носителя, а также самым различным образом влияет на скорость миграции веществ.
Состав буфера. Наиболее широко применяемые буферы — фор-миатный, ацетатный, цитратный, вероналовый, фосфатный, трис, ЭДТА и пиридиновый. Для разделения углеводов часто используют боратные буферы, преимущество которых заключается в том, что они образуют с углеводами заряженные комплексы.
Поскольку буферы служат для образца растворителями, то некоторая диффузия нанесенного образца неизбежна. Это особенно заметно для малых молекул, таких, как аминокислоты и сахара. Диффузию можно свести до минимума, если наносить образцы в виде узких полос и в умеренных количествах, использовать высокое напряжение и как можно быстрее проводить разделение, а по его завершении быстро вынимать и высушивать образцы.
Концентрация буфера. По мере увеличения ионной силы буфера компонент тока, обусловленный переносом ионов буфера, будет возрастать, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов ообразца, уменьшаться. Таким образом, скорость миграции образца уменьшится. При высокой ионной силе буфера суммарный ток увеличивается, а следовательно, возрастает и количество выделяемого тепла.
При низкой ионной силе ток, обусловленный переносом ионов буфера, уменьшается, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца, возрастает. Таким образом, миграция образца ускоряется. В буфере с низкой ионной силой общая сила тока и выделение тепла уменьшаются, но диффузия возрастает, вследствие чего разрешающая способность хуже, чем при высокой ионной силе.
Таким образом, при выборе ионной силы буфера приходится идти на компромисс. Применяющиеся обычно ионные силы лежат в интервале концентраций от 0,05 до 0,10 М. Ионная сила равна 2с23/2, где с — молярная концентрация иона, а г—его заряд.
118 Часть II. Методы разделения
pH. Для полностью диссоциирующих веществ, таких, как неорганические соли, pH практически не играет роли, но для органических соединений pH определяет степень ионизации (разд. 1.2.3). С ростом pH ионизация органических кислот возрастает, а оснований, наоборот, уменьшается, и, следовательно, меняется их электрофоретическая подвижность. На такие соединения, как аминокислоты, обладающие как кислотными, так и основными свойствами (амфолиты), pH оказывает двоякое действие (разд. 1.2.3).
Предыдущая << 1 .. 41 42 43 44 45 46 < 47 > 48 49 50 51 52 53 .. 112 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed