Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Насыщенный буфером носитель, на который нанесен образец, обычно располагают горизонтально (.горизонтальный электрофорез) на плоской поверхности изолирующего материала, например плексигласа (рис. 4.1). При горизонтальном Электрофорезе разделение можно проводить на бумаге, ацетате целлюлозы, в гелевых пластинах и в тонком слое, хотя работа с тонкими слоями при более высоких напряжениях требует применения металлических охлаждающих пластин, как при высоковольтном электрофорезе (разд. 4.4.1). Иногда гели и тонкие слои прикрывают пластиной из изолирующего материала, чтобы предотвратить испарение. Для работы с низким напряжением имеется простое оборудование для вертикального электрофореза (рис. 4.2); можно использовать пластины крахмального геля, помещая их вертикально в специальные камеры.
В полиакриламидном геле образцы разделяют на горизонтальных пластинах только при препаративном электрофорезе, а для аналитических исследований применяют цилиндрические столбики геля, поддерживаемые в вертикальном положении внутри калиброванных стеклянных трубок в специальных приборах (рис. 4.7).
Во время работы электрофоретический блок нужно закрывать крышкой, чтобы свести до минимума испарение буферного раствора и обеспечить электрическую изоляцию.
Гл. 4. Электрофорез
Рис. 4.2. Прибор для вертикального электрофореза.
1 — крышка; 3 — носитель (бумага); 3 —опора; 4— электрод; б—отсеки буферной каыеры.
4.3.2. Приготовление носителей и их свойства
Бумага. Специальной электрофоретической бумаги не существует — для электрофореза подходит обычная хроматографическая бумага. Бумагу очень удобно использовать в качестве носителя, так как она не требует никакой подготовки — ее просто нужно разрезать на куски требуемого размера. Химический состав и свойства бумаги были описаны ранее (разд. 3.3.1). При электрофорезе с использованием бумаги всегда наблюдается некоторая адсорбция; ее можно уменьшить, используя буфер с более высоким значением pH, чем изоэлектрическая точка образца, однако электроосмос вследствие особенностей химического состава бумаги всегда будет проявляться в той или иной степени.
Бумажный электрофорез — самый простой и, возможно, наиболее широко применяемый из электрофоретических методов. Он годится для разделения целого ряда заряженных веществ, однако в настоящее время его в ряде случаев вытеснил электрофорез на ацетате целлюлозы и в гелях, обладающий более высоким разрешением. При использовании всех этих носителей наблюдается значительная диффузия малых молекул; наилучших результатов удается достичь при работе с высоким напряжением (разд. 4.4.1).
Ацетат целлюлозы. Высокоочищенный ацетат целлюлозы имеется в продаже в виде тонких полос стандартного размера. Вследствие его очень незначительной адсорбирующей способности можно даже для макромолекул получить высокое разрешение с небольшим
122 Часть II. Методы разделения
количеством вещества. Ацетат целлюлозы менее гидрофилен, чем бумага, поэтому он удерживает меньшее количество буферного раствора. Следовательно, большая часть тока обусловлена ионами образца, что обеспечивает очень быстрое их разделение. Правда, это сопровождается выделением большого количества тепла, и поэтому при работе с высоким напряжением нужно принимать меры предосторожности, чтобы полосы не высохли вследствие испарения.
Электрофорез на ацетате целлюлозы широко применяется в клинических исследованиях, а в сочетании с иммунодиффузией может использоваться и для иммуноэлектрофореза (разд. 4.4.4). Отсутствие адсорбции на ацетате целлюлозы и обусловленная этим высокая разрешающая способность позволяет при использовании радиоизотопов получать четко разграниченные радиоактивные области.
Тонкие слои. Тонкие слои окиси кремния, кизельгура, окиси алюминия или целлюлозы наносят на стеклянные пластинки так же, как и при тонкослойной хроматографии (разд. 3.2.3). Пластины помещают горизонтально в аппарат для электрофореза, и тонкому слою дают возможность насытиться буфером за счет диффузии раствора из буферной камеры через соединяющие фитили. Тонкослойный электрофорез (ТСЭ), подобно тонкослойной хроматографии (разд. 3.2.3), проходит быстро и дает хорошее разрешение при высокой чувствительности.
В сочетании с хроматографией ТСЭ очень удобен для двухмерных разделений, когда после электрофореза в перпендикулярном ему направлении проводят хроматографирование. Такой метод, известный под названием «метода отпечатков пальцев», дает неоценимую возможность охарактеризовать гидролизаты белков и нуклеиновых кислот. Тонкослойные носители, подобные тем, которые описаны выше, используются и для разделения при высоких напряжениях.
Гели. Агаровые, крахмальные, полиакриламидные и другие гели следует готовить непосредственно перед использованием, а это зачастую процесс, требующий времени. Свойства гелей таковы, что и адсорбция, и электроосмос, и расширение зон в результате диффузии очень незначительны. Гель-электрофорез применяется и для препаративных целей, но гораздо более широко используется как аналитический метод и особенно ценен для разделения смесей веществ, имеющих одинаковые заряды, но слегка различающиеся массы.
