Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
106 Часть 11. Методы разделения
Рис. 3.14. Хроматографическая колонка: упрощенный (а) и усовершенствованный (б) варианты.
1 — резервуар; 2— элюирующий раствор; 3 — стеклянная колонка; 4 — наполнитель; 5 — стеклянная вата; 6 — сосуд Марнотта с элюирующим раствором; 7 — регулируемый поршень; 8 — сетка из нейлона; 9 — капиллярный шланг, соединенный с регистрирующим устройством и (или) коллектором фракций.
3.10.2. Заполнение колонки
От правильного заполнения колонки в значительной степени зависит успех разделения. Кашицеобразную суспензию сорбента, смолы или геля в подходящем растворителе осторожно вносят в колонку при закрытом кране; верхний слой суспензии перемешивают, а стенки колонки слегка простукивают, что способствует удалению попавших в колонку пузырьков воздуха и равномерному ее заполнению. Колонку заполняют суспензией до требуемой высоты, а затем открывают кран и пропускают растворитель. По мере вытекания растворителя содержимое колонки постепенно уплотняется. Для проведения этой процедуры и получения воспроизводимых
Гл. 3. Хроматографические методы 107
результатов требуется немалый опыт. Чтобы уменьшить взмучивание верхнего слоя наполнителя при внесении в колонку образца, над ним обычно помещают кружок фильтровальной бумаги или прокладку из нейлона или шелка. Некоторые фирменные колонки снабжены адаптором и поршнем, которые служат не только для предохранения верхней части колонки от повреждений, но и для ввода растворителя, обычно с помощью системы капиллярных шлангов. Необходимо следить за тем, чтобы заполненная колонка не высыхала; для этого над наполнителем должен всегда находиться слой растворителя. От правильного выбора соотношения между высотой колонки и диаметром и высотой и общим объемом наполнителя зависит количество материала, которое можно разделить; к сожалению, сказать заранее, каким должно быть это соотношение, трудно; определить его можно только путем проб и ошибок, хотя здесь накоплен уже значительный опыт — установлено, например, что для эффективного разделения частиц методом гель-фильтрации соотношение высоты колонки и ее диаметра лежит в пределах 10:1—20:1.
3.10.3. Внесение образца
Образец можно наносить на колонку несколькими способами. Самый простой из них состоит в следующем. Избыток растворителя отсасывают из верхней части колонки пипеткой, а остатку дают впитаться в наполнитель. Затем, при помощи пипетки осторожно наносят образец и также дают ему впитаться; остатки образца смывают со стенок ' колонки небольшой порцией растворителя. После этого колонку заполняют свежим растворителем, создавая слой в 5—10 см, и соединяют с резервуаром, который находится над колонкой и содержит большой объем растворителя, что позволяет поддерживать нужный слой растворителя в колонке. Другой способ внесения образца, при котором избыток растворителя остается в колонке, состоит в увеличении плотности наносимого раствора образца путем добавления раствора сахарозы до концентрации 1 %. Когда такой раствор наслаивают поверх растворителя, он опускается вниз, а затем быстро впитывается в наполнитель колонки. Вполне естественно, что данный способ применим лишь в тех случаях, когда сахароза никак не влияет на ход разделения и не мешает последующему анализу образца. Третий способ заключается в нанесении образца непосредственно на поверхность наполнителя при помощи капилляра, шприца или перистальтического насоса.
Необходимо следить за тем, чтобы колонка не была перегружена образцом, в противном случае разделение может быть некачественным. Рекомендуется вносить образец в небольшом объеме растворителя. Это позволяет сосредоточить разделяемые частицы вуз-
108 Часть II. Методы разделения
кой полосе уже в самом начале разделения. Чтобы избежать аномальной адсорбции, перед нанесением на колонку образец обессоливают.
3.10.4. Протекание элюирующего раствора
Скорость протекания элюирующего раствора через колонку в ходе разделения должна быть постоянной. Наиболее простой способ достижения этого — подача элюирующего раствора самотеком. Скорость можно регулировать, изменяя рабочее давление, которое определяется высотой столба жидкости от уровня ее в резервуаре, расположенном над колонкой, до выходного отверстия колонки. Обычные открытые резервуары для этой цели не подходят, поскольку по мере вытекания из них растворителя рабочее давление уменьшается. Чтобы этого не происходило, пользуются сосудом Мари-отта (рис. 3.14). Постоянную скорость протекания элюирующего раствора можно поддерживать и при помощи перистальтического насоса; однако при работе с ним следует соблюдать осторожность, так как применение слишком высокого давления приводит к чрезмерному уплотнению наполнителя и нарушению структуры колонки.
3.10.5. Градиентная элюция
Часто разделение на колонке проводят с помощью раствора, pH, ионную силу или полярность которого меняют. Для создания градиента смешивают два растворителя в требуемых пропорциях, пользуясь либо фирменными приборами, либо более простым устройством, состоящим из двух сообщающихся камер. Обе камеры, одна из которых (смеситель) соединена с колонкой, а другая (резервуар) соединена посредством сифона со смесителем, заполняют соответствующими растворами. По мере поступления раствора из смесителя на колонку убыль его восполняется равным объемом поступающего из резервуара в смеситель раствора, где он перемешивается при помощи мешалки. Направление градиента определяется соотношением величин pH, ионной силы и полярности растворов в резервуаре и смесителе. Характер полученных градиентов, которые могут быть линейными, «выпуклыми» или «вогнутыми», зависит от соотношения диаметров обеих камер.
