Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Уильямс Б. -> "Методы практической биохимии" -> 39

Методы практической биохимии - Уильямс Б.

Уильямс Б., Уилсон К. Методы практической биохимии — М.: Мир, 1978. — 273 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiprakticheskoybiohimii1978.djvu
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 112 >> Следующая

Для данного вида геля распределение анализируемого вещества в растворителе внутри и снаружи частиц геля определяется коэффициентом распределения Kd, который зависит от размера молекул вещества. Если молекулы крупные, в растворителе внутри частиц геля их не будет совсем; величина Kd в этом случае равна 0. Если молекулы вещества достаточно малы и могут беспрепятственно проникать внутрь частиц геля, Kd будет равен 1. Поскольку размеры пор варьируют, молекулы среднего размера будут проникать в растворитель, находящийся в порах, лишь частично; следовательно, величина Kd в этом случае будет лежать между 0 и 1. Это позволяет разделять на данном геле вещества, молекулярные веса которых различаются лишь весьма незначительно.
Гл. 3. Хроматографические методы 97
Объем выхода (т. е. объем элюата, собранного с момента внесения вещества на колонку до момента выхода его с колонки) Vе определяемся объемом растворителя между гранулами геля VD (так называемым внешним объемом), коэффициентом распределения вещества и\ объемом растворителя внутри частиц геля Vt. Таким образом,
v. = v0+Ka-vt (3.1)
Внутренний объем Vt можно рассчитать, исходя из известного сухого веса геля а и величины поглощения воды W:
Vt = aW. (3.2)
Численное значение Ve для данного вещества варьирует в зависимости от размера колонки, в то время как коэффициент распределения Кd является величиной постоянной и от геометрии колонки не зависит.
Если два вещества имеют различающиеся молекулярные веса и разные Ка (обозначим их через Ка' и Кб- ), то разность объемов выхода. будет определяться следующим уравнением:
V, = Ve - Ve = {Уо + К* Vi) - {У„ + Ке V*),
vs = (Ka>—Kd')Vi. (3.3)
Таким образом, для полного разделения двух веществ необходимо, чтобы объем исследуемого образца не превышал Va. Поскольку на практике условия разделения отличаются от идеальных (например, из-за неправильного заполнения колонки), объем образца должен быть несколько меньше величины V,; от соотношения между объемом образца и внутренним объемом Vt зависит как точность разделения, так и степень разведения образца. Для расчета оптимального объема столбика геля пользуются уравнениями (3.1)* и (3.2).
3.7.4. Гель-фильтрация; указания к проведению эксперимента
При гель-фильтрации, как и при других видах хроматографии, необходимо пользоваться эффективными колонками, особенно в тех случаях, когда разделяют вещества с близкими значениями Ка. Объем наносимого образца должен быть' по возможности небольшим; необходимо следить, чтобы в ходе элюции не происходило чрезмерного разведения или перемешивания уже разделенных компонентов.
На основании характеристик различных гелей, приведенных в табл. 3.7 и 3.8, и исходя из литературных данных о значении Kd
$8 Часть II. Методы разделения
для каждого конкретного случая можно выбрать тот или иной тип геля. Если необходимым требованиям одновременно удовлетворяют несколько гелей, то целесообразно выбирать гель с наименьшей величиной поглощения воды, т. е. с наибольшим числом поперечных связей. /
Большинство гелей выпускают двух типов — грубый и тонкий; они различаются по размеру частиц (300—100 мкм и 80—20 мкм в сухом состоянии соответственно). Тонкие гели более эффективны, поскольку уравновешивание колонки в этом случае наступает быстрее; однако скорость протекания растворителя через колонку стойким гелем относительно низка. Многие гели выпускают также в виде бусинок, что дает возможность значительно повысить скорость протекания растворителя; таким образом, бусинки представляют собой улучшенную модификацию более ранних типов порошкообразных гелей.
Перед заполнением колонки гель должен полностью набухнуть. Для этого навеску геля выдерживают в воде или лучше в слабом солевом растворе. В результате электростатического притяжения отдельные частицы геля могут слипаться; в растворах электролитов этого не происходит. Все гели набухают довольно быстро, однако для достижения равновесия все же требуется какое-то время. Это в первую очередь относится к гелям пористого типа: так, например, сефадексы G-25 и G-50 набухают в течение 8—10 ч, сефадекс G-75 — в течение суток, а сефадекс G-100 — 2 сут; для набухания сефадекса G-2Q0 требуется не менее 3 сут. Если не дать гелю предварительно набухнуть, то окончательное набухание произойдет после внесения его в колонку, что значительно снизит скорость протекания растворителя из-за слишком плотной набивки колонки.
Время набухания можно сократить до нескольких часов, нагревая суспензию геля в кипящей водяной бане в течение 1—5 ч {продолжительность нагревания зависит от типа геля). Колонку заполняют набухшим гелем, а затем обычным способом наносят образец (разд. 3.10.2 и 3.10.3), компоненты которого при непрерывном добавлении элюирующего раствора проходят через колонку. Элюат, объем которого измеряется с момента внесения в колонку образца, собирают в виде фракций, каждую из которых затем анализируют (разд. 3.10.7). Внешний объем определяют как объем, в котором из колонки выходит высокомолекулярное вещество, совершенно не проникающее в частицы геля (например, голубой декст-ран — высокомолекулярный полисахарид). Определив объем выхода данного вещества, можно рассчитать его коэффициент распределения.
Предыдущая << 1 .. 33 34 35 36 37 38 < 39 > 40 41 42 43 44 45 .. 112 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed