Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
R R R
I он- | он- |
HSN+—СН—СООН H3N+—СН—СОО" H2N—СН—СОО"
н+ н+
pH Кислый Изоионная точка Щелочной
Ионная форма Катион Цвиттерион Анион
Направление К катоду Неподвижна К аноду
движения
Таким образом, скорость и направление движения амфолитов зависят от pH, и для их разделения можно использовать буферы с диапазоном pH от 1 до 11.
Буфер, находящийся в обеих камерах, обычно идентичен тому, который используют для насыщения носителя. Однако при гель-электрофорезе, где буфер действует как составная часть носителя, он зачастую отличен от буфера, заполняющего камеры. Значение этого фактора для достижения хорошего разрешения при электрофорезе будет рассмотрено ниже (см. диск-электрофорез, разд. 4.4.3).
4.2.4. Носитель
В качестве носителей используют относительно инертные вещества, однако их состав все же не безразличен для подвижности разных веществ, и выбор соответствующей среды зависит поэтому от природы образца.
Адсорбция. Адсорбц ия — удерживание молекул образца носителем, как при адсорбционной хроматографии. Это приводит к размыванию пятен на хроматограмме, в результате чего образец движется не в виде четкой полосы, а имеет вид кометы; разрешающая способность метода при этом уменьшается. Адсорбция приводит также к уменьшению скорости миграции. Наибольшей способностью к адсорбции обладает бумага, однако это нежелательное ее свойство удается устранить, если использовать ацетат целлюлозы.
Электроосмос (электроэндосмос). Это явление обусловлено возникновением относительного заряда между молекулами воды буферного раствора и поверхностью носителя. Ионизация групп носителя и поверхностная адсорбция ионов буфера обычно приводит к образованию из молекул воды ионов гидроксония (Н30+). Так как эти ионы заряжены положительно, они движутся к катоду, захватывая растворенные нейтральные вещества и убыстряя движе-
Гл. 4. Электрофорез 119
ние катионов; скорость движения анионов при этом падает. Обычно данными эффектами можно пренебречь, однако, если определяют изоэлектрическую точку вещества, нужно вводить соответствующую поправку. Как правило, это делают, следя за движением электрически нейтральных соединений, таких, как мочевина или глюкоза.
Электроосмос менее заметен в носителе из ацетата целлюлозы или в полиакриламидном геле, чем в крахмальном геле или на бумаге.
Молекулярное сито. Свойствами молекулярного сита обладает применяемый в гель-электрофорезе полужесткий носитель (гель); такие его свойства способствуют разделению смесей заряженных макромолекул, например белков, которые различаются не только по электрофоретической подвижности, но также формой и размерами. Гели состоят из беспорядочно переплетающихся молекулярных цепей, распределенных по всему объему геля и образующих ситоподобную структуру. В соответствии с конкретными требованиями разделения размер пор гелей можно варьировать в некоторых пределах. Принцип действия молекулярного сита в агаровом, крахмальном и полиакриламидном гелях заключается в том, что крупные молекулы движутся сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор, который определяется числом поперечных сшивок в геле. При использовании гелей типа сефадекса ситуация обратная— в соответствии со спецификой их природы миграция малых молекул тормозится сильнее, чем крупных (разд. 3.7.2).
4.3. Общие методы
4.3.1. Оборудование
Оборудование, необходимое для электрофореза, состоит в основном из двух частей: источника питания и собственно электрофоретического блока. Описываемое здесь оборудование применяется для работы с низким напряжением. Высоковольтный электрофорез — более специальный метод; он рассмотрен в разд. 4.4.1.
Источник питания генерирует стабилизированный постоянный ток и имеет системы контроля напряжения и силы тока на выходе. Для работы с низким напряжением применяются источники питания с выходным напряжением до 500 В и силой тока до 150 мА, которые обеспечивают либо постоянное напряжение, либо постоянную силу тока.
В электрофоретический блок входят электроды, буферные камеры, опора для носителя и прозрачная изолирующая крышка (рис. 4.1 и 4.2). Можно пользоваться электродами из нержавеющей стали, но поскольку некоторые буферы вызывают коррозию, предпочтительнее платиновые электроды. Обе буферные камеры
120 Часть II. Методы разделения
iv;I F ' V 1
Рис. 4.1. Прибор для горизонтального электрофореза.
7 носитель; 2 — крышка; 3 — электрод; 4 — отсеки буферной камеры; 5 — изолирующая пластина; 6 — фитиль-мостик.
обычно разделены на два отсека: электродное отделение и отделение для фитиля-мостика. Электрический контакт между буферными растворами в обоих отделениях осуществляется за счет маленьких отверстий или щелей в перегородке между отделениями или с помощью пористых фитилей. Контакт между носителем, всегда насыщаемым буфером до начала электрофореза, и буфером, находящимся в камерах, обычно поддерживается с помощью фитилей-мостиков из нескольких слоев фильтровальной бумаги или марли. Коммерческие фитили, покрытые оболочкой, можно использовать неоднократно. При низковольтном электрофорезе на бумаге можно обойтись без мостиков —¦ контакт создается за счет непосредственного погружения бумаги в буферный раствор.
