Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
ферментах.)
Гл. 3. Хроматографические методы 113
James А. Т., Morris L. J., New Biochemical Separations. Van Nostrand, London (1964). (Обзор различных хроматографических методов и области их применения.)
Stahl Е., Thin Layer Chromatography — a Laboratory Handbook. 2nd edn. Allen & Unwin, London, 1969. (Описание систем, применяющихся при разделении биологических молекул методом тонкослойной хроматографии.)
Дополнительная литература
Хайс И. М., Мацек К. (ред.). Хроматография на бумаге, пер. с чешек. ИЛ, М., 1962.
5-502
Глава 4
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
4.1. Введение
Многие важные в биологическом отношении молекулы, такие, как аминокислоты, пептиды, белки и нуклеиновые кислоты, содержат ионизующиеся группы, поэтому в растворе они могут существовать в заряженной форме, в виде катионов (+) либо анионов (—). Кроме того, молекулы с близкими по величине зарядами, но> различающимися молекулярными весами отличаются друг от друга отношением заряда к массе. На всех этих различиях основано разделение ионов при движении их в растворе под действием электрического поля; в этом и состоит принцип электрофореза.
Скорость движения катионов к катоду и анионов к аноду зависит от соотношения между движущей силой электрического поля, действующей на заряженные ионы, и замедляющими движение силами взаимодействия между молекулами и окружающей средой, в основном силами трения и электростатическими силами. Подлежащий электрофоретическому разделению материал растворяют или суспендируют в буфере; чтобы обеспечить проведение электрического тока, этим же буфером насыщают и носитель (разд. 4.3.3). В растворе между электродами ток обусловлен ионами буфера и образца, а в остальной части цепи — электронами. Ток в цепи поддерживается за счет электролиза, происходящего на электродах, каждый из которых погружен в большую буферную камеру. В процессе электролиза на катоде образуются ионы гидроксила и молекулярный водород, а на аноде — молекулярный кислород и ионы водорода:
Катод Анод
2е" + 2Н20 -* 20Н- + H2f Н20 2Н+ + 1 /2 021 + 2е~
Образование на катоде гидроксильных ионов приводит к увеличению диссоциации компонента буферной смеси (НА), представляющего собой слабую кислоту (разд. 1.2.2). Вследствие этого возрастает количество ионов А-, проводящих ток к аноду. На аноде ионы А“ соединяются с протонами, при этом снова об-
Гл. 4. Электрофорез 115
разуется НА, а электроны поступают в электрическую цепь. Каждая буферная камера разделена на два отсека, сообщающихся между собой через небольшие щели или с помощью фитилей из полосок фильтровальной бумаги. В одном отсеке находится электрод, а в другом — носитель (бумага, гель) в контакте с буфером (рис. 4.1). Разделение камеры на отсеки нужно для того, чтобы изменение pH буфера, происходящее у электрода, не сказывалось на буфере, которым насыщен носитель.
Если снять электрическое поле до того, как ионы исследуемой смеси достигнут электродов, компоненты смеси распределятся в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Таким образом, электрофорез представляет собой незавершенную форму электролиза.
В свободном растворе сопротивление движению ионов за счет трения между ними и раствором минимально, что обусловливает -быстрое продвижение ионов. Поскольку близкие по структуре молекулы обладают близкими зарядами, в электрическом поле они передвигаются совместно в виде полосы с границами раздела, образованными веществами с несколько различающимися электрофоретическими подвижностями. Метод электрофореза, называемый в соответствии с этим методом подвижной границы, требует слишком сложной и дорогостоящей аппаратуры, чтобы его можно было использовать в повседневной лабораторной практике; в данном руководстве мы ограничимся рассмотрением электрофокусирования я изотахофореза (разд. 4.4.5 и 4.4.6.)
Применимость электрофореза для разделения заряженных веществ, начиная от маленьких неорганических ионов и кончая большими макромолекулами, в значительной степени зависит от того, проводится ли он на или в инертном и относительно гомогенном носителе. Иногда намеренно применяют носитель, специфически взаимодействующий с ионами, которые подвергаются разделению, т. е. используют не только различия в отношении заряд/масса, но и в соответствии с конкретными требованиями создают определенные замедляющие силы.
Существует много различных типов носителей: листы хроматографической бумаги или ацетата целлюлозы, тонкие слои окиси кремния или алюминия, крахмальные, агаровые и полиакриламидные гели; всех их насыщают соответствующим буфером. Выбор носителя определяется конкретными условиями анализа. Общая для ¦всех носителей особенность состоит в том, что разделяемые вещества движутся в виде отчетливых зон, которые затем легко обнаружить соответствующим аналитическим методом (табл. 4.1). Этот метод, который получил название зональный электрофорез, широко применяется как в препаративных, так и в аналитических целях.
S*
116 Часть II. Методы разделения
4.2. Факторы, влияющие на подвижность
