Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Гл. 3. Хроматографические методы 103
CNBtfR(CH2) NHj
НО НО НО НО
CNBr/NHj (СН2) NHZ
о О
1 |
C=NH C=NH
1
| (<-на
R NH2
______Янтарный ангидрид/ВРК
Производные
шомочввинн
RCOOH/BPK
NH I
СО
(снг)а
со I
NH
I R
Рис. 3.13. Возможные пути сшивания лиганда с агарозой или сефарозой.
Буквой R обозначен лнганд, с которым связывается макромолекула, символом ВРК обозначен водорастворимый карбодиимид. Для простоты приведена реакция только с одной
из гидроксильных групп.
правило, амино-или карбоксильную группу), осуществляется при помощи соответствующих методов органического синтеза. Иногда удлиняющий «мостик» является частью самого лиганда; в этом случае он непосредственно пришивается к матрице с помощью бром-циана. Некоторые из возможных реакций сшивания лиганда с матрицей приведены на рис. 3.13.
3.8.4. Адсорбция и элюция при аффинной хроматографии на колонке
Колонка для аффинной хроматографии заполняется связанной с лигандом матрицей и уравновешивается тем же буферным раствором, который используется для растворения исследуемого соединения. Буферный раствор должен иметь такие pH и ионную силу, чтобы обеспечивать оптимальные условия для сшивания лиганда с
104 Часть II. Методы разделения
белком. После нанесения исследуемого препарата и связывания макромолекул колонку промывают другими буферными растворами для удаления неспецифически адсорбированных примесей, а затем элюируют макромолекулы.
Характер элюции зависит исключительно от константы скорости k_i_. Если сродство макромолекулы к лиганду высоко, то даже в самых благоприятных условиях элюция будет протекать довольно медленно (1—2 ч). Обычно в элюирующий раствор добавляют свободный субстрат или ингибитор, что предотвращает повторное связывание макромолекул с лигандом. Лучше всего проводить элюцию при комнатной температуре (или температуре несколько выше комнатной) и время от времени прекращать пропускание растворителя. Обычно pH и(или) ионную силу элюирующего раствора направленно изменяют, добавляя такие реагенты, как 0,1 М раствор уксусной кислоты или гидроокись аммония. При этом происходят небольшие изменения конформации макромолекул, способствующие высвобождению лиганда, но не вызывающие их денатурации.
3.8.5. Применение аффинной хроматографии
Лучшим доказательством огромных возможностей данного метода является постоянное увеличение числа ферментов и других белков, очистку которых проводят методом аффинной хроматографии. Характерно, что в число таких ферментов входят и некоторые аллостерические ферменты, такие, например, как глутаминсинтетаза. Кроме того, аффинная хроматография применяется для очистки антител, антигенов и нуклеиновых кислот. Одной из важнейших областей применения метода становится изучение гормонов и рецепторов лекарственных веществ, а также сложных клеточных структур, анализ которых до настоящего времени был в значительной степени затруднен.
В последние годы все большее применение в лабораторной практике и в промышленности находят так называемые ферменты в твердом состоянии. Ферменты, иммобилизованные путем ковалентного связывания с нерастворимой матрицей (подобно тому, как это делается в аффинной хроматографии), обладают неоспоримыми преимуществами по сравнению со свободными ферментами. Они гораздо более термостабильны, обладают высокой устойчивостью к про-теолизу и могут использоваться на колонке. В этом состоянии они сохраняют свою каталитическую способность при пропускании через колонку растворов, содержащих субстрат, что в конечном итоге приводит к получению свободного от фермента продукта и позволяет повторно использовать фермент. Регенерировать несолюби-лизированный фермент без потери его активности можно также с помощью фильтрации или центрифугирования.
Гл. 3. Хроматографические методы 105
3.9. Жидкостная хроматография под высоким давлением
В последние годы появились приборы, позволяющие проводить разделение соединений методом хроматографии под высоким давлением. В этом случае неподвижную фазу помещают в узкую стальную колонку, в которую затем под давлением нагнетают подвижную жидкую фазу. Применение высокого давления позволяет использовать значительно более длинные колонки и одновременно существенно сокращать время разделения. Метод универсален, поскольку может применяться во многий видах хроматографического разделения: адсорбционной хроматографии, распределении в системе жидкость—жидкость, а также ионообменной и гель-проникаю-щей хроматографии. .Оборудование для жидкостной хроматографии под давлением включает обычно одну или несколько детекторных систем для непрерывной регистрации выхода элюата из колонки.
ЗЛО. Общие приемы хроматографии на колонке
В этом разделе рассматриваются некоторые наиболее важные вопросы, связанные с практическим применением метода хроматографии на колонке—одного из самых распространенных методов практической биохимии.
3.10.1. Колонка
Стеклянная хроматографическая колонка должна быть устроена таким образом, чтобы неподвижная фаза доходила до самого ее дна, т. е. чтобы «мертвое пространство» у основания колонки было минимальным; в противном случае уже разделившиеся частицы будут скапливаться на дне и перемешиваться. Для этого в. основание фирменных колонок впаивают, например, пористую стеклянную пластинку, на которую помещают съемную сетку из нейлона, а затем наносят неподвижную фазу. Другой, еще более простой и дешевый способ состоит в том, что на дно колонки кладут тамнон из стеклянной ваты с небольшим количеством кварцевого песка или мелких стеклянных шариков. При выходе из колонки элюат через систему капилляров поступает в детектор и (или) в коллектор фракций (рис. 3.14). Если в ходе разделения необходимо поддерживать постоянную температуру, можно надевать на колонку термостатируемую «рубашку», внутри которой циркулирует жикость, подаваемая из термостата при помощи насоса.
