Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
![](/pic/spacer.gif)
![](/pic/spacer.gif)
Для получения данным методом хороших результатов требуется значительный навык и экспериментальное искусство, и поэтому он применяется в основном для специальных исследований. Его можно использовать не только для разделения заряженных молекул, но и для фракционирования клеток различных типов, клеточных орга-яелл и фрагментов мембран.
Гл. 4. Электрофорез 13)
4.4.3. Диск-электрофорез
Прибор для диск-электрофореза показан на рис. 4.7. Он состоит из двух сосудов с буфером — верхнего и нижнего, соединенных, между собой рядом вертикальных цилиндрических стеклянных, трубок (рабочие трубки), содержащих гель (рабочий гель и гель-прокладку). В нижнем сосуде находится анод, а в верхнем — катод. Образцы наносят на поверхность столбиков геля при заполненном буфером нижнем сосуде, затем буфером заполняют и верхний сосуд, ставят на место крышку и включают ток. Буферные растворы подбирают таким образом, чтобы разделяемые вещества были в них. заряжены отрицательно. По мере их движения через гель вниз, к. аноду, происходит разделение, обусловленное различиями отношений заряда к массе. Диск-электрофорез называют еще «прерывистым» электрофорезом (в отличие от непрерывного, проточного). Это название отражает особенность метода, заключающуюся в использовании неоднородной («прерывистой») среды (гелей) и буферов разного состава и с разными значениями pH. Верхняя треть-столбика геля состоит из крупнопористого геля-прокладки, или концентрирующего геля, а нижняя — из рабочего, или разделяю-щего, геля с более мелкими порами.
Роль концентрирующего геля заключается в концентрировании образца по мере его прохождения через этот гель; в результате образец подходит к рабочему гелю в виде черезвычайно узкой полосы. Рабочий гель действует по принципу молекулярного сита (разд. 4.4.2). pH буфера в верхнем сосуде меньше, чем буфера, насыщающего гель, и благодаря этому различию образец по мере прохождения через гель-прокладку концентрируется. Наглядно принцип, лежащий в основе диск-электрофореза, проиллюстрирован на примере разделения белков на рис. 4.8.
Рис. 4.7. Прибор для диск-электрофореза.
J — электрический провод (к катоду); 2 — крышка с электродом в сборе; 3 — верхний сосуд для буфера; 4 — резиновые вкладыши; б — электрический провод (к аноду); 6 — блок с нижним электродом; 7 —рабочие трубки; 8 — нижннй сосуд с буфером.
132 Часть II. Методы разделения
Ю
Обозначения
ЦБелок Щ^Ионы хлора | |Глицинатные ионы
Рис. 4.8. Разделение с помощью диск-электрофореза (с любезного разрешения компании Shandon Southern Instruments Ltd.)-
t — верхний сосуд; 2 — стеклянный капилляр; 3 — хлопчатобумажное волокно; 4 — образец, pH 6.7; б — трис-НС1, pH 6,7; € — трис-НС1, pH 8,9; 7 — рабочая трубка; 8 — гель-прокладка, Б%-иый полиакриламид; 9 — рабочий гель, 7,5%-иый полиакриламид; 10 — электрод; /./—градиент напряжения; 12 — трис-глицин. pH 8,3; 18 — трис-глнцин, pH 9.62 М-» нижний сосуд; / — нанесение образца; II и III — начальная и конечная стадии электро*
фореэа.
Верхний гель имеет высокую пористость, и в связи с этим крупные молекулы проходят через него практически свободно. Следовательно, в этой части геля подвижность белков приближается к таковой для свободного раствора.
В состав буфера как в верхнем сосуде, так и в концентрирующем теле входит слабое аминное основание — трис, но если в верхнем -сосуде дополнением к трису служит слабая кислота глицин и образуется трис-глициновая буферная система, то концентрирующий тель содержит сильную кислоту — НС1, что дает буферную систему трис-HCl. Таким образом, pH в концентрирующем геле примерно на 2 единицы ниже, чем в верхнем сосуде. Глицин в верхнем ¦сосуде при pH 8,3 на 95% находится в виде цвиттериона (СН2(N+H3)COO“) ,‘и только 5% приходится на долю глицинатного -аниона (CH2(NH2)COO“) (см. уравнение Гендерсона—Хассель-бальха, разд. 1.2.3).
Белок наносят при pH концентрирующего геля, и он имеет очень небольшой суммарный отрицательный заряд. В электрическом поле глицинатные ионы, движущиеся из верхнего резервуара в концентрирующий гель, имеют гораздо меньшую подвижность, чем
Гл. 4. Электрофорез 133
ионы хлора и, следовательно, «тянутся» позади них. В среде верхнего геля, имеющей более низкое значение pH, подвижность гли-цинатных ионов становится еще меньше, так как в результате дополнительного протонирования увеличивается количество цвитте-рионов. Ионы хлора, напротив, продвигаются очень быстро, и между этими двумя разновидностями ионов возникает граница раздела. Так как и ионы хлора, и глицинатные ионы представляют собой часть одной и той же электрической системы, то в области локализации менее подвижных глицинатных ионов напряжение увеличивается, а в области более подвижных ионов хлора — уменьшается. Следовательно, замыкающие ионы будут стремиться догнать ведущие, а белковые анионы, промежуточные по подвижности, будут располагаться между первыми и вторыми ионами. В итоге происходит концентрирование белковых анионов позади ведущих ионов. Образуется чрезвычайно узкая белковая полоса, которая подходит к рабочему гелю вслед за ионами хлора.
![](/pic/spacer.gif)
![](/pic/spacer.gif)
![](./design/pic/spacer.gif)
![](/pic/wildcat.gif)