Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
К образцам, представляющим собой белковые смеси, для улучшения их солюбилизации добавляют мочевину или додецилсульфат натрия. В состав смесей довольно часто включают также краситель, например бромфеноловый синий. Наблюдая за его движением, можно получить некоторое представление о поведении системы в ходе разделения.
Разделение. После нанесения образца включают источник питания, поддерживая соответствующее напряжение в течение всего процесса разделения. Даже при наличии стабилизированных источников питания необходимо постоянно следить за работой прибора, так как если носитель подготовлен недостаточно тщательно, возможен перегрев, а в случае применения бумаги — даже ее обугливание. Низковольтный электрофорез обычно завершается в течение 1—2 ч, хотя для разделения белков на бумаге требуется немного >больше времени. Разделение при высоком напряжении, как прави--ло, заканчивается в течение 1 ч. По окончании электрофореза сна--чала выключают источник питания, а затем извлекают носитель.
Извлечение носителя. Бумагу, полоски ацетата целлюлозы и тоннослойные пластины извлекают и сушат прямо на воздухе, обычно в печи при 110°С. Для извлечения цилиндрических полиакриламидных гелей столбик геля обводят струей воды под давлением, ¦применяя для этого шприц для подкожных инъекций. Благодаря .этому гель отстает от стенок трубки, и его выталкивают. Для умень-
126 Часть II. Методы разделения
шения диффузии веществ, подвергшихся разделению, гели при необходимости помещают в фиксирующий раствор, например 7%-ный раствор уксусной кислоты.
Окрашивание и извлечение веществ. Большинство биологических соединений не окрашено, и для определения их местоположения по завершении разделения необходимо каким-то образом сделать их «видимыми». Для этого применяются методы, упомянутые при рассмотрении тонкослойной и бумажной хроматографии (разд. 3.2.3 и 3.3.1).
Таблица 4.1
Методы окрашивания соединений после электрофоретического разделения
Вещество
Реактив
Примечание
Белки
Г ликопротеиды
Липопротеиды
Пептиды
Нуклеиновые кислоты
Полисахариды Кислые мукополисахари-
ДЫ
Нигрозин в уксусной или трихлоруксусной кислоте1
Бромфеноловый синий — ZnS04 — уксусная кислота2
Лиссамин зеленый в уксусной кислоте3 Окисление йодной кислотой с последующей обработкой реактивом Шиффа4 Судан черный в 60%-ном этаноле8 Хлорирование С10а или NaOCl с последующей обработкой раствором крахмала с KI или бензидинуксусной кислотой®
Метиловый зеленый — пиронин7
Иод8
.Толуидин синий в смеси метанол — вода*
Очень чувствительный Количественный
Реагирует со всеми соединениями, содержащими NHa-группы
При связывании с РНК красный, с ДНК — голубой
* Ortega М., Nature, Lond., 179, 1086 (1957).
1 Jencks W. P., Jetton M. R., Durrum E. L., Blochem. J., 60, 205 (1955).
* Discornbg G.. Jones R. F.. Wtnstaniey D. P., J. clin. Path., 7. 106 (1954).
* Koiw E., Gronwail A., Scand. J. cl In. Lab. Invest., 4,244 (1952).
* Swahn B., Scand. J. clln. Lab. Invest., 5, Suppl. 9. (1953).
* Rydon H. N.. Smith R. W., Nature Lond., 169, 922 (1952).
' Delmel М.. Blochem. Z., 325 , 358 (1954).
* Foster A. B., Newtcn-Hearn P. A., Stacey М., J. Chem. Soc. Part 1. 30 (1956).
« Relnits K. G.. Blochem. J., БЗ. 79 (1953).____________________________________________
Наиболее широко практикуемый метод определения местоположения веществ после электрофореза на бумаге, ацетате целлюлозы и в геле — это обработка среды красителем, который избирательно
Гл. 4. Электрофорез 127
окрашивает компоненты образца. Примеры подобных методов окрашивания даны в табл. 4.1. Если краситель количественно взаимодействует с компонентами смеси, то можно определить количество окрашенного вещества одним из двух способов. Во-первых, можно вырезать соответствующий участок носителя и экстрагировать из него соединение подходящим растворителем, а затем каким-либо методом, например спектрофотометрически, определить его количество. Если носителем является ацетат целлюлозы, его растворяют в органическом растворителе, например ацетоне; окрашенное вещество оказывается при этом в растворе. Во-вторых, носитель можно сканировать с помощью денситометра. Этот прибор измеряет количество света, проходящего через узкую полоску носителя при перемещении его перпендикулярно световому лучу. Количество света, прошедшего через среду и попавшего на детектор денситометра, связано обратной зависимостью с количеством окрашенного вещества. На приборе записывается серия пиков, соответствующих положению окрашенных зон. Калибровку прибора проводят, снимая показания денситометра для известных количеств данного компонента, нанесенного на носитель и обработанного красителем. Совершенно очевидно, что нужно стремиться к минимальному фоновому окрашиванию носителя. В этом отношении полосы из ацетата целлюлозы имеют преимущество перед бумажными: ацетат целлюлозы становится прозрачным, если погрузить его в жидкий парафин. Окрашенные зоны при этом становятся более отчетливыми. Избыток красителя с полос ацетата целлюлозы и из гелей удаляют многократным погружением их в какой-либо растворитель, например разведенную уксусную кислоту.
