Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Work T. S., Work E., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. Vol. 1. North-Holland Publishing Co., Amsterdam (1969).
Перечисленные источники содержат подробную информацию о методах и оборудовании, применяемых при электрофорезе. Более детальные сведения о специальных методах, оборудовании и их применении содержатся в серии брошюр Instrument Applications (Shandon Southern Instruments Ltd.) и Science Tools (L.K.B. Instruments Ltd.)
Дополнительная литература
Маурер Г., Диск-электрофорез, нер. с нем., изд-во «Мир», М., 1971.
ДОПОЛНЕНИЕ К ЧАСТИ II
Выбор методов разделения
Выделение и очистка определенного соединения из сложной смеси преследует одну из двух целей. При аналитическом разделении задача состоит в том, чтобы проанализировать вещество качественно и (или) количественно. При этом обычно имеют дело с небольшими количествами вещества, не обязательно задаваясь целью получить его после разделения обратно. При препаративном разделении задача состоит в получении вещества в высокоочищенном состоянии и в максимально возможных количествах, чтобы на следующих этапах исследовать его химические и (или) биологические свойства,. При аналитическом и препаративном подходах пользуются разными методами выделения и очистки, и обусловлено это главным образом тем, что при препаративном подходе имеют дело с гораздо большими количествами исходного материала, и нет необходимости применять методы, дающие высокий выход.
Аналитическое разделение
Аналитическое разделение может проводиться качественно, как ускоренный метод идентификации компонентов смеси. Если при аналитическом разделении поведение изучаемого вещества совпадает с поведением некоего известного вещества (стандарта), это означает, что скорее всего эти два вещества идентичны. При оценке поведения этих двух веществ необходимо использовать методы с возможно более высокой разрешающей способностью, а стандартное вещество должно подвергаться в точности такой же обработке и в то же самое время, что и исследуемое соединение. Такой подход позволяет избежать дальнейшего исследования соединения физическими методами для установления его структуры.
Для определения концентрации исследуемого соединения в исходном препарате не всегда необходимо проводить его предварительное выделение и очистку. Если соединение обладает каким-либо уникальным свойством, это свойство можно взять за основу при его количественном определении. Примером таких уникальных особенностей может служить биологическая специфичность: существуют методы количественного определения ферментов в интакт-
Дополнение 139
ных клетках и клеточных органелл ах. В гл. 5 приводятся некоторые спектрофотометрические методы количественного определения белков* В тех случаях, когда таких уникальных свойств у соединения нет, перед проведением количественного анализа это соединение необходимо выделить и очистить.
Любые способы очистки всегда сопряжены с неизбежными потерями материала, поэтому число стадий очистки нужно сводить до минимума. Следовательно, необходимо стремиться применять те методы, которые способны давать самую высокую степень разрешения с небольшим количеством материала. К ним относятся в первую очередь тонкослойная хроматография, тонкослойный электрофорез, газожидкостная хроматография, электрофорез на ацетате целлюлоз зы, диск-электрофорез, ионообменная и аффинная хроматография. Из них наиболее предпочтительной является, по-видимому, газожидкостная хроматография (в тех случаях, где она применима), так как этот метод обладает высокой разрешающей способностью и чувствительностью и может быть использован как для качественного, так и для количественного анализа. В данном случае особые преимущества дает применение детекторов азота, что позволяет ограничиться минимальной предварительной очисткой.
Аффинная хроматография в тех случаях, когда она применима, особенно ценна для разделения биологических молекул, так как основана на их биологической специфичности. Теоретически этим методом можно добиться полной очистки и высокого выхода. Потенциальные возможности метода использованы далеко не полностью, особенно в отношении его применения для выделения больших количеств материала. Распределительную, адсорбционную и проникающую хроматографии на колонках для аналитических целей, как правило, не применяют вследствие их низкой разрешающей способности и значительных потерь материала.
Препаративное разделение
Методы разделения с высокой разрешающей способностью обычно имеют ограниченную емкость, и для разделения больших количеств материала не используются. При препаративном разделении первая из применяемых стадий обычно имеет большую емкость, но как следствие этого может давать плохое разрешение. Здесь применяют такие методы, как осаждение, диализ, адсорбция, жидкостно-жидкостная хроматография на колонке и противоточное распределение. Хотя их разрешающая способность хуже, чем у многих других, зато они позволяют разделить большие количества материала. На конечных стадиях очистки используют методы с высоким разрешением, например ионный обмен, препаративный гель-электрофорез, препаративную газожидкостную хроматографию.
