Методы практической биохимии - Уильямс Б.
Скачать (прямая ссылка):
Спектроскопические методы позволяют обнаруживать незначительные количества вещества даже в довольно сложных системах. Так, например, удается измерять количество восстановленных и окисленных дыхательных пигментов в целых митохондриях.
5.1. Основные принципы
5.1.1. Излучение, энергия и структура атомов
Свет, тепло и другие виды электромагнитного излучения представляют собой электромагнитные волны, распространяющиеся со скоростью 3-10® м-с-1. Для понимания механизмов, лежащих в основе спектральных свойств молекул, воспользуемся представлением о квантовой природе электромагнитного излучения. Согласно квантовой механике, свет представляет собой поток частиц, называемых квантами или фотонами. Энергия каждого кванта определяется длиной волны излучения.
В основном энергетическом состоянии электроны в атоме занимают самые нижние энергетические уровни, располагаясь на них в
142 Часть III. Аналитические методы
I
I
6
«?§ щ-Ц is $*-
S,V0-
ЭНЕРГИЯ
$сУз ¦ SgVz ' Wr S„y„-
Энергетический
\Е-л
'.Га
-4s
-Зр
-3S
-2р
-2S
-Is
-, Вращательные —‘подуровни
Потеря энергии за счет столкно-| вений,
1
Поглощенная
энергия
Энергия
флуоресценции
Рис. 5.1. Энергетические уровни и электронные переходы в атоме натрия (а) и флуоресцирующей органической молекуле (б).
-Для ясности вращательные подуровни приведены только для колебательного подуровня SiVi.
-соответствии с законами квантовой механики. На рис. 5.1,а приведена схема, иллюстрирующая основное энергетическое состояние атома натрия, содержащего 11 электронов. При поглощении кванта энергии электрон переходит из основного состояния в более высокое, возбужденное, при этом энергия кванта должна точно соответствовать разности соответствующих энергетических уровней. Переход электрона из возбужденного состояния в основное сопровождается испусканием кванта, или, иначе говоря, излучением света определенной длины волны.
При образовании молекул электроны атомов занимают новые лоложения, появляются новые энергетические уровни. Атомы в молекуле могут колебаться и вращаться вокруг связей, и это при-
Гл. 5. Спектроскопические методы 143
водит к возникновению около электронных уровней молекулы колебательных и вращательных подуровней (рис. 5.1,6). Каждый электрон в молекуле, как и в атоме, занимает самый нижний энергетический уровень, при этом молекула находится в основном состоянии. Приобретая энергию, электрон переходит на более высокий энергетический уровень — другими словами, переходит в возбужденное состояние. Поскольку в молекулах каждое основное и возбужденное электронное состояние разбивается на ряд энергетических подуровней, спектры молекул являются, как правило, полосатыми. Из-за отсутствия колебательных подуровней спектры атомов довольно простые, линейчатые.
Как и в атомах, в молекулах переход электрона с одного уровня на другой сопровождается поглощением или испусканием кванта энергии. В первом случае мы получаем спектр поглощения молекулы, а во втором — испускания.
Е = Et — Е2 = hv,
где Е — поглощенная или излученная молекулой энергия, Ех — первоначальная энергия электрона, Е2 — конечная энергия электрона, h — постоянная Планка, равная 6,63х 10-34 Дж-с, v — частота колебаний в Гц. Частота колебаний v = с — скорость света, равная 3- 10е м-с-1, Я — длина волны излучения, равная—,
где v — волновое число.
Длина волны обычно измеряется в микрометрах (мкм), сантиметрах (см), нанометрах (нм) или ангстремах (А). Миллимикроны (ммк) и микроны (мк) применять не следует.
5.1.2. Типы спектров и их применение в биологии
Спектр представляет собой зависимость количества поглощенной или излученной системой энергии от длины волны или другого параметра, например волнового числа.
Молекулы взаимодействуют с излучением в широком диапазоне длин волн, поэтому их спектры лежат в разных областях (рис. 5.2). Для измерений в каждом спектральном диапазоне используется специальное оборудование. Одни типы спектров получить довольно легко, и соответствующие методы широко используются биохимиками в повседневной работе. Однако есть область спектроскопии, где применяется довольно сложное оборудование. Соответствующие методы используются лишь для детального исследования биологических макромолекул и других субклеточных структур.
Электронные спектры обусловлены переходом электронов наружных оболочек атомов с одного энергетического уровня на другой, и спектры занимают видимую и ультрафиолетовую области^
144 Часть III. Аналитические методы
Вис?%‘й Ш-о&шсть
в -./л \.ё,Чзкая \ Далекая ТЬдийдиа-
Диапазон ВакуумныиУФ УФ ^ИШгаат \ ^ МШласть Микроволновая область д пазон
