Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
Waters Assoc., США), биобедс (фирма Bio-Rad Labs., США), мер-когель (на
основе поливинилацетата; фирма Е. Merck, ФРГ).
8.3. ПРОСТРАНСТВЕННЫЕ ГРУППЫ
Если низкомолекулярные соединения функционируют в качестве аффинных
лигандов, то для приготовления эффективного специфического сорбента
необходимо в большинстве случаев ввести так называемую пространственную
"ножку", т. е. пространственную группу между аффинным лигандом и
поверхностью нерастворимого носителя. Вопрос о пространственной
доступности низкомолекулярных аффинных лигандов для комплементарных
участков биологических макромолекул детально уже обсуждался в разд. 5.1.
При синтезе аффинного геля возможны два подхода. Согласно первому, лиганд
(в состав которого входит пространственная группа) синтезируется в
свободном виде в растворе классическими методами органической химии,
очищается и присоединяется к матрице геля на последней стадии. Некоторые
исследователи предпочитают именно этот подход, поскольку в гель не
вводятся незащищенные пространственные группы, которые содержат ионные
группировки, обусловливающие неспецифическую сорбцию; этот вопрос
подробно рассматривается в разд. 10.3. Второй подход состоит во
встраивании пространственной группы в гель на первой стадии с последующим
связыванием аффинного лиганда на второй стадии. Берри и сотр. [3]
сравнили две методики и показали преимущества последней. Привязка
пространственной группы к гелю с последующим прикреплением аффинного
лиганда обычно технически менее сложна, особенно для неспециалистов в
органической химии.
При этом отпадает вопрос о введении и удалении защитных
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
211
групп. При твердофазном синтезе значительно облегчается удаление
непрореагировавших соединений, поскольку они могут быть удалены простой
промывкой. Однако первый метод требует обычно сложного фракционирования
аффинных лигандов, модифицированных пространственной группой, Хотя
связывание пространственной группы с агарозой проводится, как правило, в
водной среде, имеется ряд примеров применения неводных растворителей,
например пиридина или метаАва, при связывании аффинных лигандов на
пространственной группе. Среди реакций присоединения имеются и такие,
использование которых для привязки пространственных групп приводит к
сшиванию геля, что ведет к его стабилизации.
Берри и др. [3] подчеркивают, что неопецифическое связывание обусловлено
не столько наличием незамещенных пространственных групп, сколько природой
их связи с носителем (например, появлением положительного заряда после
привязки алкиламина к агарозе после активации бромцианом; ср. разд.
8.2.4) и, более того, природой самого носителя (гидрофобные
взаимодействия в случае гидрофобных пространственных групп), а также
побочными реакциями, сопровождающими связывание. В качестве примера
приводится часто используемый метод привязки аффинного лиганда с помощью
водорастворимых карбодиимидов. Когда NAD+ присоединяют к иммобилизованной
пространственной "ножке", между аминогруппами адениновых остатков и
карбоксильными группами "ножек" должны образоваться амидные связи, "ели
для конденсации применяется карбодиимид. Однако Берри и О'Карра [4]
показали, что образуется эфирная связь с гидроксильными группами остатков
рибозы. Поэтому для присоединения нуклеотидов к пространственной группе
они рекомендуют другие методы. Внимательное изучение табл, 11.1, где
всегда указывается, присоединяется ли пространственная группа к аффинному
лиганду или к нерастворимому носителю, позволяет сделать вывод о пользе
индивидуального подхода в выборе методики.
В настоящее время привязка пространственных групп к нерастворимому
носителю преобладает.
; Как видно из табл. 11.1, одними из наиболее частых комбинаций геля и
пространственной группы, используемых для связывания низкомолекулярных
аффинных лигандов, являются сефароза с присоединенным
гексаметилендиамином (в продажу поступает как АН-сефароза) или сефароза с
е-аминокапроновой -кислотой (СН-сефароза). Для их связывания с аффинными
лн-Тйндам'И, несущими первичную алифатическую или ароматическую Змино-
или карбоксигруппу, используется реакция конденсации .{карбодиимидный
метод). Ниже приведена схема этой реакции
14*
Глава 8
R-С/ + С ------------------>
V- II pH 4-5
0 N
*1
Ц н+
В качестве конечной стадии может быть:
а) нуклеофильная атака, приводящая к получению ацилну-клеофильного
продукта и мочевины соответствующего карбодии-мида;
б) образование тиоэфирной связи;
в) превращение промежуточной О-ацилизомочевины в N-анил-мочевину в
результате внутримолекулярного переноса ацильного остатка. Связывание
карбоксильной группы с нуклеофилом может протекать почти количественно в
присутствии избытка карбо-диимида и нуклеофильного реагента.
Для синтеза сорбентов используются преимущественно водорастворимые
карбодиимиды, такие, как хлоргидрат 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)
карбодиимида (ЭДК)
