Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
в
Получение полиметилакрилата
Лаурилсульфат натрия (0,25 г), свежеперегнанный метилакрилат (5 мл), %-
ную тиогликолевую кислоту (1 мл) и персульфат аммония (0,125 г) после-
двательно при перемешивании магнитной мешалкой (под тягой) добавляют к 0
мл дистиллированной воды. Эмульсию нагревают с обратным холодильником ;5
ч на водяной бане (80 "С) до исчезновения запаха мегилакрилата,
| После полимеризации эмульсию вливают при перемешивании в 100 мл ледяной
воды, к которой добавляют 100 мл 2 н. соляной кислоты. Продукт, ко-(ррый
коагулирует в виде белых хлопьев, выдерживают 30 мин на холоду. Затем
Еромывают декантацией большим количеством холодной воды.
Жалучение полиакрилгидразида
Полиметилакрилат (5 г) диспергируют в 70 мл тидразингидрата (98%-ный
Цтвор). Реакционную смесь энергично перемешивают и нагревают при )00°С
S кипящей водяной бане. Через 3 ч нагревания получают прозрачный густой
створ. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры,
нерастворимые частицы отфильтровывают через марлю и фильтрат вливают при
постоян-
216
Глава 8
ном перемешивании в 500 мл охлажденного во льду метилового спирта, содер-
жашего 1 мл ледяной уксусной кислоты. Осадок отфильтровывают, промывают
холодной смесью метанола и уксусной кислоты (500:1) и вновь растворяют в
. 150 мл воды. Нерастворимые частицы удаляют фнльтроваинем. Этот раствор
может быть немедленно использован для присоединения к сефарозе или
лнофиль-но высушен с предосторожностями при удалении даже небольших
следов влаги, чтобы не произошло сшивания продукта.
Получение полиакрилгидразид-сефарозы
Сефарозу 4В активируют бромцианом. Активированную сефарозу суспендируют в
трех объемах охлажденного раствора полиакрилгидразида в воде или 0,1 н.
бикарбонате натрия (см. предыдущую методику) и реакционную смесь при
слабом перемешивании оставляют на ночь при 4°С. Конъюгат промывают 0,1 М
хлорида натрия до отрицательной реакции (отсутствие окрашивания промывных
вод с 2,4,6-тршштробензолсульфонатом натрия). Получают носитель,
содержащий в 1 мл агарозы до 120 мкмоль/мл доступного гндразида.
Производные с содержанием гндразида 15,25 мкмоль/мл использованы для
дальнейших замещений тем же методом, который описан для присоединенных
монофункциональных гидразидов. Методы приготовления производных гидразид-
сефарозы показаны на рис. 8.5.
Производные полиакрилгидразид-сефарозы ведут себя как идеальные
нерастворимые носители для аффинной хроматографии. Они сохраняют свойства
сефарозы, в особенности минимальное неспецифическое взаимодействие с -
белками, хорошие фильтрующие свойства и высокую пористость. Кроме того,
они механически и химически устойчивы. Эти производные обладают также
преимуществами акриламидных гелей. При нейтральных pH они не несут заряда
и содержат большое число групп, способных модифицироваться.
8.4. БЛОКИРОВАНИЕ НЕПРОРЕАГИРОВАВШИХ ГРУПП
Когда связывание аффинного лиганда на нерастворимом носителе закончено,
рекомендуется удалить остающиеся активные группы, чтобы исключить
дальнейшее связывание. Если аффинный лиганд связывается своими
аминогруппами, в качестве инактивирующих агентов наиболее часто
используются низкомолекулярные первичные амины. Например, согласно
рекомендациям фирмы Pharmacia, при связывании на сефарозе, активированной
бромцианом, инактивация остающихся активных групп может быть достигнута
достаточно просто при взаимодействии с 1 М 2-ами-ноэтанолом при pH 9 и
комнатной температуре в течение 2 ч, в то же время после связывания на
эпоксиактивнрованной сефарозе для инактивации в тех же условиях требуется
4 ч. Используется тот же буфер, что и при связывании, например 0,1 М
бикарбонат натрия, содержащий 0,5 моль/л хлорида натрия. Для бло-
0*0
NADP
н<\ РНК
Iff >- t
^C-NHN
1 >н- !
HQ
-nhn-Белон
Агароза,
окисленная NoIO* РНК
белок________
' глутаралъдегид
о о
I II к ,
rC-nhnhc -белок
Полиакрилгидразид
С
I
сн,
NH*
II* 4 , И -3*C-Nri-NH-C-C И
NHj
0-С- NH-NH-C-CH
О
оуч-О-ё-к
-C-NHHHC^^^-NOj
NalS1Q4
I-ch./nhnhJ ~^О^гСнг^н j} Цнг Jn кди~^----¦
о о
II II
-C-NHHHC
Ynh,
-C-NH-NH-C-CH^-CHj-COOH
о о о С-NHNHC-СН4СНгС-HHfCHt^-Nrij
о
он
JH *
9 °* Тг
C-NH-NHC-CH-COCH,
о о C-NHNHC-CHjBr
S-NHNHC-^^I
он
Рис. 8.5. Методы получения производных гидразид-сефарозы [90].
218
Глава 8
кирования используются и другие первичные низкомолекулярные амины, такие,
как глюкозамин. Сандберг и Хёглинд [69] использовали насыщенный раствор
глицина (в карбонатном буфере, pH 9,5) и показали, что он не вносит
вклада в неспецифическую сорбцию. Смит [68] также исследовал инактивацию
глицином групп активированной бромцианом сефарозы. Действие 10 М глицина
при 2°С в трис-буферном солевом растворе (pH 8,5) фактически
предотвращает последующее связывание yG-[131I]глобулина. Рош и др. [62]
блокировали группы активированной бромцианом сефарозы после связывания
подчелюстного муцина 2-ами-но-2-оксиметилпропандиолом-1,3, а Ратнер [60]
после связывания РНК-полимеразы нейтрализовал остающиеся активные группы
