Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 81

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 198 >> Следующая

H.N-
H0-
HS-
204
Глава 8
Продолжение табл. 8.5
Реагент Формула Основная реагирующая группа
Глутаральдегид H*N-
Г сксаметилендиизоци-анат <j"C=N- (CH^-N-C- О H*N-
N,N'- (1,3-Фенилен) бис-малеимнд <*Q-o о HS-
Фенол-2,4 -дисульфонил- хлорйд Ч-''Чо1С1 h2n-
Реагент Вудворда ^tCHrCHj -COOH к NHS-
Присоединение белков к полиакриламидным гелям с помощью глутарового
альдегида
Уэстон и Аврамес [86] разработали метод прямого связывания
аффинных лигандов полиакриламидными гелями с помощью глутарового
альдегида, который, присутствуя в избытке, реагирует одной из своих
альдегидных групп со свободной амидной группой полиакриламидного геля.
Остающаяся свободная активная группа реагирует затем с аминогруппой
аффинного лиганда, вводимого в последующей реакции связывания. Таким
образом возникает прочная связь между носителем и аффинным лигандом.
Биогель Р-300 оставляют набухать в воде и дважды промывают 4-кратным
объемом 0,1 М фосфатного буфера (pH 6,9). Затем 19,4 мл геля (содержащего
1 г сухих гранул в объеме 45 мл) смешивают с раствором глутарового
альдегида (4,8 мл 25%-ного раствора) и выдерживают 17 ч при 37 °С. Гель
промывают и центрифугируют 4 раза с 4-кратным объемом 0,1 М фосфатного
буфера
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда____________205
(pH 6,9), затем три раза 0,1 М фосфатным буфером (pH 7,7). Присоединяемый
белок вводят, смешивая 3 мл геля в 13,5 мл буфера, pH 7,7, и 0,3 мл
раствора фермента (20 мг/мл) при 4°С в течение 18 ч на встряхивателе
(шейкере). После проведения реакции гель отделяют центрифугированием и
промывают. Этим методом можно присоединить 70 мг кислой фосфатазы к 1 г
сухого геля.
Ряд других бифункциональных производных, упомянутых главным образом Лоу и
Дином [41], перечислены в табл. 8.5.
Примеры использования акриламидных гелей в аффинной хроматографии
включены в табл. 11.1,
8.2.7. Оксиалкилметакрилатные гели
Гидрофильные оксиалкилметакрилатные гели, предложенные как носители для
аффинной хроматографии Вихтерле и Лимом [88], получены Чоупеком и др. [9]
полимеризацией суспензии с^сиалкильных эфиров метакриловой кислоты и
алкилендимета-крилата при различных соотношениях мономера и инертных
компонентов. Число реакционноспособных групп в геле, его пористость и
удельная поверхность могут меняться в очень широких пределах. Гель имеет
следующую структуру:
<fHj ?н3 сн, <fH,
-с----сн,-с -сн,--------с--------сн, с-
со со <Ь Ьо
0 icHjCHjOH осн4снгон <!>
сн, сн,
1 ( 1
сн, сн,
Iе I *
0 о
1 I
СО и f*u со
I Vhj ii I
-с----сн,-^-сн,---------с-------сн,--с-
I '1 ь I
сн, со со
г
зсн,снгон оснгсн4он
Гели выпускаются фирмами Lachema (ЧССР) и Realco Chemical Со. (США) под
названием сферон.
Связывание химотрипсина и глицина на сферонах семи типов приведено в
табл. 8.1. Гели образуют правильные сферические гранулы и различаются по
химической и физической стабильности. Они хорошо выдерживают
хроматографию под давлением и не меняют свою структуру после 8-часового
нагревания при 150°С в 1 М растворе глнколата натрия или после 24-
часового кипячения в 20%-ной соляной кислоте. Они биологически инертны и,
подобно акриламидным гелям, не атакуются микроорганизмами. С ними можно
работать в присутствии органических растворителей, которые имеют
некоторые преимущества при связывании
206
Глава 8
пептидов с этими гелями [79]. Гидроксильные группы геля обладают
свойствами, аналогичными свойствам агарозы. После активации бромцианом
эти группы связывают аффинные лиганды через их аминогруппы точно так же,
как и в случае сефарозы [77; 80]. Активация геля и связывание аффинного
лиганда по существу идентичны методикам, описанным для связывания на
агарозе.
Связывание белков и пептидов на оксиалкилметакрилатных гелях С помощью
активированных эфиров [10, 77]
Аминокислоты и белки присоединяются к и-нитрофениловым эфирам производных
оксиалкилметакрилатного геля (НФОМ) по схеме
CONH(CHj)jCONHR
Скорость освобождения "-нитрофенола может быть определена путем измерения
оптической плотности раствора при 400 нм. Одновременно со связыванием
аминокислот или белков на НФОМ--геле имеет место гидролиз n-
нитрофениловых эфиров в водной среде в присутствии избытка гидроксил-
ионов. На рис. 8.4 показано влияние pH на освобождение "-нитрофенола при
связывании фенилаланина- на НФОМ-геле. Зависимость от pH эффективности
связывания фенилаланина и сывороточного альбумина на НФОМ-гелях
иллюстрируется данными тэбл. 8.6. Очевидно, что наибольшие количества
фенилаланина связываются при pH 9. Этот выра-
Таблица 8.6
Иммобилизация фенилаланина и сывороточного альбумина человека на НФОМ-
геле в зависимости от pH среды
pH Фенилаланин, мкмоль/г Сывороточный альбумин" ¦ЙКНОЛЬ/г
7 Следы
8 1,12 0,138
9 16,1 0,156
10 3,83 0,151
И 1,68 0,И2
12 Следы 0,125
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
207
женный оптимум pH обусловлен величиной р/( а-аминогруппы аминокислот
(7,6-8,4). Поскольку НФОМ-гель связывает аминокислоты только по их
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed