Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
добавляют к раствору 100 мг фермента в 10 мл того же буфера. Через 60 мин
смесь подвергают гель-фильтрации при 4 °С через сефадекс G-25 (50X2 см) в
карбонатном буфере (pH 10,6).
Энзакрилполитиолактон содержит тиолактонное кольцо и связывает белки
непосредственно через алифатические аминогруппы и фенольные оксигрушш.
Полиакриламидные гели устойчивы при pH 1-10 и хорошо -выдерживают все
обычные элюенты. В них отсутствуют заряженные группы, и поэтому ионный
обмен с хроматографируемыми веществами минимален. Полиакриламидные гели
биологически инертны и не атакуются микроорганизмами, так как
представляют собой синтетические полимеры. Поскольку частицы геля сильно
прилипают к чистым стеклянным поверхностям, Инман и Динт-цис [30]
рекомендуют пользоваться лабораторной посудой из си-ликонизированного
стекла или полиэтилена.
Реакцией с подходящим соединением полиакриламидные гели 'Можно превратить
н носители для связывания ряда аффинных Лигандов [30]. Аминоэтильные
производные готовят путем обработки большим избытком этилендиамина при
90°С, а гидразид-ные производные-избытком гидразина при 50°С. Аминоэтиль-
ные производные полиакриламидных гелей можно перевести в л-
аминобензамидоэтильные производные реакцией с л-нитробен-зоилазидом в
присутствии М,М-диметилформамида, триэтиламина и тиосульфата натрия.
После активации азотистой кислотой гидразидное производное может
привязывать аффинные лиганды через их аминогруппы
Полиакриламидные гели, содержащие остатки ароматических аминов, после
диазотирования азотистой кислотой связывают аффинные лиганды
преимущественно по их ароматическим остаткам
-сн-снг
сн-снг -снснг-
СО-NH-Белок
сн г-Белок
202
Глава 8
0
Те же гели, активированные тиофосгеном, связывают аффинные лиганды,
реагируя со свободными аминогруппами последних
Методики присоединения белков на производных полиакриламидных гелей всех
трех типов приведены ниже.
Присоединение белков к выпускаемым промышленностью производным
полиакриламида (энзакрилам)
Присоединение аффинных лигандов к полиакриламидным гелям, содержащим
ароматические амины (энзакрилу АА), после активации азотистой кислотой
К охлажденной до 0°С суспензии 100 мг энзакрнла АА в 5 мл 2 М соляной'
кислоте добавляют 4 мл охлажденного льдом 2%-ного нитрита иатрия и смесь
15 мин перемешивают магнитной мешалкой. Образующийся дназоэнзакрил
промывают 4 раза буфером, в котором будет присоединяться аффинный лиганд
(например, фосфатным буфером, pH 7,5). После центрифугирования и
декантации добавляют аффинный лиганд, например 2,5 мг фермента в 0,5 мл
подходящего буфера. Реакционную смесь оставляют на 48 ч при перемешивании
магнитной мешалкой. Реакцию заканчивают добавлением охлажденного льдом
раствора фенола (0,01%) в ацетате иатрия (10%-иый раствор). Через 15 мин
энзакрил с присоединенным аффинным лигандом вначале отмывают разбавленным
буфером, затем промывают тем же буфером, содержащим 0,6 моль/л хлорида
натрия. Промьгвка должна быть проведена очень тщательно. Производитель
(фирма Koch-Light) рекомендует сначала провести все операции с неди-
азотированным энзакрнлом, чтобы определить лучшие условия для промывки
адсорбированного материала. Аффинные лиганды, связанные с носителем по
этой методике, могут быть снова получены в свободном виде в мягких
условиях путем обработки 0,1 М дитионитом натрия в 0,2 М борате натрия
при pH 9.
Присоединение аффинных лигандов к полиакриламидным гелям, содержащим
ароматические амины (энзакрилу АА), после активации тиофосгеном
К суспензии, содержащей 100 мг энзакрнла АА в 1 мл 3,5 М фосфатного
буфера (pH 6,8-7,0), хорошо перемешиваемой магнитной мешалкой, прибавляют
ОД мл 10%-ного тиофосгена в хлороформе. После 20-минутного интенсивного
перемешивания прибавляют еще ОД мл раствора тиофосгеиа, а еще через 20
нии (перемешивание) NCS-энзакрил (промывают одни раз ацетоном, дважды 0,5
М бикарбонатом натрия и дважды буфером, используемым при присоединении
лиганда (например, боратным буфером с р!1>8,5). После центрифугирования и
декантации добавляют 0,5 мл раствора аффинного лиганда (например, 2,5 мг
фермента) и реакцию проводят согласно предыдущей методике.
Активация гидразидных производных полиакриламидного геля (энэакрилэ АН)
азотистой кислотой и последующее присоединение проводят таким же
способом, как это описано для энзакряла АА.
-СН-СН(- CO-NH
-сн-сн,-
I * .
Бифункциональные реагенты
Таблица 8.5
Реагент
Формула
Основная реагирующая, группа
Бисдиазобензидии
3,6-Бис- (меркуриме-тил)диоксан
Бисоксираны
Диэтилмалонимидат
л, п'- Дифтор-н, л'-динит-родифенилсульфон
Дим етила дипнннм идат
Дииетнлсуберииидат
Дивинилсульфои
N.N'-Этилеибисиодацет-
амид
+н9-сн*'н?5'снг-н9+
СГЦ-CH-R-CH -СН"
V v
+МНг*с-CH.-c''"'1 н5с,о-' Г
NHj.
NOj, о
.NO,
о
>Hj
+NV-(CH >-сГ ' HjCO^ ** SdCH;
"NH.
>-(СНД-СТ_ HjCO-^ ^>cHj
СН^СН-^-СН^СН*
о
ICHjCONHICHjIjNHCOCHjI
Фенольный HO-
HS-
-ОН к NH.-
h2n-
HaN-, фенольный HO-
HSN-
