Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
промывкой 0,1 М 2-меркаптоэтанола. Фирма рекомендует для удаления
активных групп активированной бромцианом сефарозы суспендировать гель в
трис-буфере (pH 8) в течение 2 ч. Влияние тех немногих зарядов, которые
вводятся при использовании триса или глицина, можно подавить, если
использовать относительно высокие концентрации солей при аффинной
хроматографии. Почти полное удаление этих активных групп может быть,
однако, достигнуто даже при простом стоянии геля в течение ночи в
слабощелочном растворе.
В гелях, которые содержат активные сложноэфирные группы для прямого
ковалентного связывания (например, активированная СН-сефароза, аффигель
10 или оксиалкилметакрилатные гелн с /г-нитрофенильной сложноэфирной
группой), непрореагировавшие группы удаляют путем обработки 0,1 М трис-
буфером (pH 8): через 1 ч в геле практически не остается групп, способных
связывать белки или пептиды. Для носителей, которые содержат альдегидные
группы в качестве активных связывающих групп, после связывания
преимущественно используется восстановление борогидридом натрия. При этом
происходит и восстановление остающихся альдегидных групп, стабилизация
связей между белком и нерастворимой матрицей.
Если аффинный лиганд связан с пространственной группой, может случиться,
что часть молекул пространственной группы, обычно содержащих на своем
конце амино- или карбоксигруппы, остается незанятой. Непрореагировавшие
карбоксильные группы пространственных "ножек" Рейфстин и др. [59] удаляли
блокированием 0,5 мМ трис-(2-амино-2-оксиметилпропандиолом-1,3) и 1,6 мМ
Ы-циклогексил-П/-[2-(4-морфолйн)этил]|Карбодиимид-мето-л-
толуолсульфонатом. Ниже приводится методика блокирования карбоксильных
групп, предложенная Уайтли и др. [87]. >
15 мл сефарозы, содержащей привязанный через гексаметиленднамии и
янтарный ангидрид 5-фтор-2'-дезоксиуридин-5/-(л-аминофеннл) фосфат,
суспендируют в 50 мл смеси (1:1 по объему) диметилформамида и 0,1 М
какодилат-ного буфера (pH 4,5), содержащих 1,1 г глицинамида. К суспензии
добавляют
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
219
2 г хлоргидрата 1-этил-3-(З'-диметиламинопропил)карбодиимида,
растворенного в 10 мл той же смеси, и перемешивают 12 ч при комнатной
темпратуре. Если аффинный лиганд привязан к СН- или АН-сефарозе с помощью
реакции с кар-бодиимидом, фирма рекомендует продолжить связывание (после
привязки аффинного лиганда) с помощью карбодиимида с глюкозам ином [17]
или 2-амино-этанолом в случае СН-сефарозы или с уксусной кислотой в
качестве блокирующего агента для аминогрупп АН-сефарозы.
Незамещенные аминогруппы могут быть блокированы также уксусным ангидридом
[32].
Суспензию 60 мл сефарозы, к которой D-галактоно-а-лактон привязан через
бензидин, озвучивали в 100 мл воды, содержащей 2 мл уксусного ангидрида,
в течение 10 мин в резонаторе типа бани.
Блокирование непрореатировавших аминогрупп с помощью уксусного ангидрида
использовали также Гиеровский и Бродерсен [27], однако при этом
происходило освобождение билирубина, привязанного к АН-сефарозе
карбодиимидяы-м методом.
При получении специфических сорбентов перед аффинной хроматографией
необходима еще одна подготовительная стадия, заключающаяся в тщательном
промывании ото всех веществ, которые ковалентно не связаны с поверхностью
нерастворимой матрицы. Наиболее часто лучшие результаты получались, если
промывки проводились либо щелочными, либо кислыми буферными растворами с
высокой ионной силой (разд. 8.2).
8.5. ДЕСОРБЦИЯ ПРИСОЕДИНЕННОГО АФФИННОГО ЛИГАНДА
Серьезным ограничением использования аффинной хроматографии в системах с
высоким сродством (например, гормои-рецептор-ные взаимодействия) и для
выделения пико- и наномольных количеств белков является относительно
легкое отщепление аффинных лигандов в раствор. Эти аффинные лиганды
связаны преимущественно монофункционально с активированной бромцианом
сефарозой через пространственную группу. Механизм отщепления аффинных
лигандов, связанных с активированной бромцианом сефарозой, в присутствии
соединений, содержащих нуклеофильные группы, обсуждался в разд. 8.2.4.
Освобождение лиганда из агарозы с привязанным 8-(е-аминокапронил-3-
аминоэтилтио) аде-нозин-3',5'-цихломонофосфатом в зависимости от времени
и pH показано на рис. 8.6 [74].
Для более подробного изучения десорбции аффинных лигандов со
специфических сорбентов Тессер и др. [75] готовили сорбенты путем
привязывания аденозин-3',5'-цикломонофосфата и других веществ через
различной длины пространственные группы к активированным бромцианом
агарозе, целлюлозе и сшитому декстрану, а также к полиакриламиду через
образование амидной связискарбо-
220
Глава 8
ксильными группами носителя по Инману и Динтцису [30]. Число
индивидуальных отщепляемых лигандов зависит от pH и времени; из характера
этой зависимости следует, что десорбция аффинных лигандов с матрицы
происходит преимущественно в местах прикрепле-
Рис. 8.6. Отщепление лиганда от агарозы с атарозой описана ЛуденсОМ
