Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
аминогруппам в непротонированной форме, эти кислоты только в очень
небольших концентрациях способны сорбироваться аффинным носителем при pH
7 и 8. При рН> >8,5 количество присоединяемого фенилаланина значительно
воз-
Рис. 8.4. Зависимость от pH (буферные растворы Бриттона - Робинсона)
отщепления n-нитрофенола в ходе связывания фенилаланина на НФОМ-геле.
/ - pH 7; г-pH 8; 3 - pH 9; 4 - pH 10; S - pH 11; 6 - pH 12.
растает. Напротив, при рН]>10 наблюдается существенное уменьшение
содержания связанного фенилаланина из-за увеличения концентрации
конкурирующих гидроксильных ионов, которые значительно ускоряют гидролиз.
В табл. 8.6 показана кроме того зависимость количества свя-.Занного
сывороточного альбумина от pH. Наибольшее количество связывается также
при pH 9. При более высоких pH в случае белка наряду с возрастанием
концентрации гидроксильных ионов растет и число NH2-rpynn, способных
связываться (для е-амино-групп лизина р/С 9,4-10,6). Из характера
зависимости количества фенилаланина, связанного с НФОМ-гелем, от
концентрации фенилаланина, взятого для связывания, установлено, что для
ваилучшего связывания необходима относительно высокая кон-
0
го t,o
Время, мин
60
208
Глава 8
центрация аминокислоты. Например, при концентрации феиил-аланина 10
мкмоль/мл на 1 г геля связывается 10 мкмоль фенилаланина, в то время как
при концентрации фенилаланина 50 мкмоль/мл - только 30 мкмоль.
Для связывания пептидов и белков использовались также метакрилатные гели
с эпоксидными группами. Изучение реакции с глицил-l-лейцином и ацетил-l-
лейцином показало, что связывание а-аминогруппы с эпоксигруппой
существенно зависит от pH (оптимальное значение pH 9,7), в то время как
связывание карбоксильной группы, понвидимому, от pH не зависит. Этот
факт, а также то обстоятельство, что скорость реакции е-аминогруппы с
эпоксидной группой на порядок -ниже скорости для ос-амино-группы, по-
видимому, могут объяснить, почему присоединение сывороточного альбумина и
трипсина к этим гелям эффективнее при кислых, чем при щелочных pH [78].
Обзор применений сферонов включен в табл. 11,1,
8.2.8. Стекло и его производные
Наиболее важным неорганическим нерастворимым носителем без сомнения
является стекло, которое очень часто используется для приготовления
иммобилизованных ферментов и реже сорбентов для аффинной хроматографии. В
табл. 8.7 перечислены марки некоторых хроматографических пористых стекол
и фирмы, производящие их.
Модифицированные стекла обладают превосходной устойчивостью и не
атакуются микроорганизмами. Однако в некоторых
случаях они обнаруживают нежелательную неспецифическую адсорбцию [14]. В
проспектах фирмы Corning Glass Works рекламируется стекло, обработанное
у-аминопропилтриэгоксисиланом, как подходящий носитель для ряда аффинных
лигандов [46, 82, 83]. Найдено, что процесс силанизации представляет
собой реакцию гидроксильных групп на поверхности стекла с
аминофункциональным силаном
1 -
L 9~CH*"CHj i о-сна-сн3
-о-А-он * CH,-CH,-o-ii-o-(cn!lrNH1 . -o-Si-o-Iwc;,),-(tm),
о О-ГН-ru 1 I
J о о-снг-сн3
Реакция протекает в метиловом спирте и -воде при 25 °С, и образующееся
алкиламиностекло может быть использовано для иммобилизации аффинных
лигандов и ферментов. Аффинные лиганды могут быть связаны с аминогруппами
производных стекла " своими карбоксильными группами при использовании
раствори-
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
209
Пористые стеклянные хроматографические материалы
Таблица 8.7
Марка Предел исключения молекулярной массы по Фирма-производитель
декстринам полистиролам
Биоглас 200 Биоглас 500 30 000 100 000 Bio-Rad Labs., США
Биоглас 1000 Биоглас 1500 Биоглас 2500 V 500 000 2 000 000 9 000 000
CPG-10-75 28 ООО Waters Assoc,, США;
CPG 10-125 48 ООО Corning Glass Works.
CPG 10-175 68 ООО США
CPG 10-240 95 000 120 000
CPG 10-370 150 000 400 000 .
CPG 10-700 300 000 1 200 000
CPG 10-1250 550 000 4 000 000
CPG 10-2000 1 200 000 12 000 000
мого карбодиимида, своими аминогруппами после активации тио-
фосгеном, а также ароматическими остатками азосвязью с производными
ариламинов, как это видно на следующей схеме:
I
о
N
О
I
0
-O-SilCHiUlCS +
1 *3
О
S
II
аса
о
11 ж-
НО-С-ЙАПМГ
I
О
0
1
г
с=о
NH
- 0-Si(CHj)3NCS
0
1
I
о
нм-белак
-о-suchj)jNhcnh~ Белок
I
о
0
1
I
О
NONO.
HCl
-o-iacHjjjNHCH^-N^Ncr
0
1
I
о
- O-SUCHjljNHC-^^-NSNCr
Белок
О
N=N-
I
Белок
210
Глава 8
Примеры использования стекла в аффинной хроматографии приведены в табл.
11.1.
8.2.9. Другие носители
К носителям, используемым для аффинной хроматографии (табл. 11.1)
отнесены также и такие, как сополимеры аминокислот, виниловые сополимеры,
найлоновые и полистирольные матрицы, окись никеля; подробности,
касающиеся их применения, можно найти в цитируемой литературе. Из
упомянутых носителей в продаже имеются полистирольные гели, которые
известны, например, под названиями порагель, стирагель и аквапак (фирма
