Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
вероятностной функцией распределения Пуассона и распределением х2-
Грибно и Тессер [25] предложили уравнение десорбции: их вывод основан на
четырех основных предположениях: а) при
/ = 0 все молекулы лиганда присоединены к матрице максимальным числом
связей л; б) разрыв связей лиганд - матрица протекает с кинетикой
псевдопервого порядка (принимается, что концентрация гидроксил-ионов в
буферном растворе постоянна);
в) прочность всех связей лиганд-матрица одинакова, и их разрыв
характеризуется одинаковым значением константы скорости k\ г) разрыв
связей происходит последовательно, т. е. данная нумерация связей
подразумевает, что связь 2 будет атаковаться группой ОН", только если
овязь 1 уже разорвалась, и т. д.
Оставив в силе первые три допущения (а - в), можно предположить
неупорядоченную нуклеофильную атаку гидроксильны-
Таблица 8.9
Значения kt при разных п и С^/а {расчет на ЭВМ)
cN/a
п ¦ 10-2 •10-1 ¦ 10-" -10-8 • KJ-1D -10-12
1 0,10-Ю-1 0,10-ю-3 0.10-10-° 0,10-10-7 0,10-10-° 0,10- Ю-ч
2 0,15-10° 0,14-10-1 0,14-10-" 0,14-10-* 0,14-10-1 0,14-10-0
5 0,13-Ш1 0,44-10° 0,17-10° 0,66-ю-1 0,26-10-1 0,10-101
10 0,41-Ю1 0,22-10' 0,13-Ю1 0,77-10° 0,47-10(r) 0,29-10°
Таблица 8.8
Результаты решения уравнения (8.3) для и от 1 до 6
п к*п
1 0,69
2 1,68
3 2,67
4 3,67
5 4,67
6 5,67
224
Глава 8
ми ионами. Это эквивалентно предположению, что порядок разрыва связей
лиганд- матрица не зависит от нумерации [39].
Если а - общая концентрация лиганда (мкмоль/мл), a s - число
гидролизуемых связей, то
a=c"-f • • • + c"_s+ • • • + Со,
где Со-концентрация свободного лиганда. Число различных форм лиганда с s
расщепленными связями составляет =/i!s! х
Х(я-s)!. Эти (") формы кинетически вырождены вследствие допущения (в), т.
е. вероятность атаки любой из (п-s) остающихся связей на следующей стадии
та же, что и на предыдущей.
При записи дифференциальных уравнений следует учитывать статистические
факторы. Если k - константа скорости псевдопервого порядка,
пропорциональная вероятности разрыва данной связи в течение определенного
'времени, то вероятность того, что любая связь лиганда, имеющего п точек
связывания, будет разорвана, пропорциональна nk. Статистический фактор
для лигандов с (л-1) точками связывания равен (п-1) и т. д.
Можно записать следующее:
dcn!dt=-nkcn, dcn.Jdt - nkcn-(л-- I) kc".lt dcn^/dt=(n- 1) kcn_t-(tt 2)
kcn_2
и т. д. Решение этих дифференциальных уравнений легко найти по методу
Бернулли или Лагранжа
с"=аехр {-nki),
crt_j =па (ехр [ - (п - 1) kt]-exp (-nkt)},
Cn-г-п (л- 1) (а/2) (ехр [-(и-2)'kt\-
-2 ехр Г - (я - 1) Ы] + ехр (- nkt) ],
"j а 2 (<"I>'"' ехР \ - {n-r)kt\. (8.5)
Откуда следует уравнение десорбции
са/а= 1 -J] - ("-¦r)kt]. (8.6)
s-=0 r=0 ' (r) / V /
Это уравнение можно переписать в виде
c0fa = 1 - J (") (- I)4"1 ехр (-skf). (8.7)
4-1 \S/
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда____________225
Таблица 8.10
Время половинной десорбции Тп, рассчитанное по уравнению (8.8), для
Л"=2,51(Н мин~1а
п V сут
Модель, предполагающая последовательные реакции Модель,
предполагающая неупорядоченные реакция
1 19,16 19,16
2 46,67 34,17
3 74,67 43,89
4 101,94 51,11
5 129,72 56,67
6 157,50 61,67
1 к найдена экспериментально 1251.
k - экспериментальный измеряемый параметр, поэтому время половинной
десорбции Тп можно вычислить из
V,-ij ^ j (-l)*~l exp <-sfet*). (8.8)
Зависимость освобождения лиганда от времени вычисляется из уравнения
(8.7). Форма получаемых кривых качественно та же, что и в модели Грибно и
Тессера [25], хотя аналитически уравнение десорбции отличается [ср.
уравнение (8.7)].
Рассчитанные по уравнению (8.8) итеративным методом Ньютона- Рафсона
значения kxn сопоставлены с полученными Гриб-но и Тессером [25] (табл.
8.10). Заметно, что йтп с возрастанием п увеличиваются более плавно, чем
в модели Грибно и Тессера. Объяснение этого неожиданного результата
состоит в том, что устойчивость, приобретаемая благодаря дополнительным
точкам связывания лиганда, частично компенсируется увеличением
вероятности разрыва связи лиганд-матрица. Для п=1 обе модели дают одно и
то же значение kx\. Этому условию удовлетворяет статистическая модель.
8.6. ОБЩИЕ ЗАМЕЧАНИЯ, КАСАЮЩИЕСЯ ВЫБОРА СОРБЕНТОВ, ПРОСТРАНСТВЕННЫХ
ГРУПП И МЕТОДОВ СВЯЗЫВАНИЯ И БЛОКИРОВАНИЯ
Как уже упоминалось в вводной части этой главы, при выборе носителя во
внимание следует принимать не только свойства, вытекающие из самой сути
аффинной хроматографии или природы иммобилизованных ферментов, но также и
сферу использования этих методов. Другим важным фактором является быстрое
расши-
226
Глава 8
Руководство для
Матрица ф и л ьтру ющи е свойства Десорбция При pH 7,25 °С
Проницаемость для высокоиолекул яр-ных веществ
Пористое стекло Отличные Незначительная Очень высокая
Полиакриламид Хорошие Низкая Высокая
Оксиалкилметакрилатные гели Отличные Незначительная "
Целлюлоза Прекрасные Умеренно низкая Умеренная (переменная)
