Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
СНз
CHj- CHi-N=C=N-CHl-CH4-CHi-N -HQ
CHj
и мето-п-толуолсульфонат 1-циклогексил-3-(2-морфолиноэтил) карбодиимида
(цмк).
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
213
Главное преимущество этих карбодиимидов состоит в том, что
;оответствующие производные с мочевиной растворимы в воде й поэтому могут
быть легко удалены из геля промыванием водой. По Jloy и Дину [41]
конденсация с помощью карбодиимида проводится при pH 4,7-6,5 в течение
1^-72 ч при концентрации карбодиимида 2-100 мг/мл. ^
В качестве примера ниже описано приготовление эстрадиолсе-фарозы [12],
300 мг З-О-сукцинил-Pl эстрадиола в 400 мл диметилформамида добав-тяют к
40 мл влажной аминоэтил-сефарозы 4В. Диметилформамиа требуется для
эастворения эстрадиола; если аффинные лиганды растворимы в воде, в нем
нет необходимости. Добавляя 1 н. соляную кислоту, в суспеизни
поддерживают >Н 4,7. Затем в течение 5 мнн прибавляют 500 мг (2,6 ммоль)
1-этил-3-(диме-гиламинспропил)карбоднимнда в 3 мл воды и реакционную
смесь оставляют при комнатной температуре на 20 ч. Замещенную сефарозу
переносят в колонку и промывают 50%-ным водным раствором диметилформамида
до отсутствия ра-пноактивности в элюате. Рекомендуется для промывания
использовать 10 л раствора и проводить его в течение 3-5 дней. По этой
методике 1 мл влажной сефарозы может связать ~ 0,5 мкмоля эстрадиола.
Из других производных сефарозы Куатреказас [12] приготовил
бромацетамидоэтил-сефарозу реакцией О-бромацетил-Ы-окси-гукцинимида с
эминоэтил-сефарозой, сукциниламиноэтил-сефаро-Ву реакцией с янтарным
ангидридом, производные диазония из и-аминобензамидоэтил-сефарозы, а
также тирозил-сефарозу и Сульфгидрил-сефарозу. Присоединение аффинных
лигандов со свободными карбоксильными группами к сульфгидрил-сефарозе
осуществлялось посредством тиосложноэфирных связей с помощью
водорастворимых карбодиимидов. И напротив, к носителям, содержащим
карбоксильные группы, с помощью карбодиими-fca можно присоединить
соединения, содержащие тиольные группы. Тиосложноэфирная связь может быть
специфически расщеплена гидроксиламином, что создает возможность простого
отделения интактного комплекса лиганд - белок от матрицы.
В разд. 5.1 обсуждались гидрофобные и гидрофильные свойства
пространственной группы. О'Карра и др. [51] упоминают три гипа аффинных
лигандов, иммобилизованных через гидрофобные (А, Г и Ж) и гидрофильные
(Б, В, Д, Е и 3) пространственные Группы: А--В - иммобилизованный
оксамат; Г - Е - a30-NAD+-связанный в 8-положение; Ж и 3-6-
меркаптопуриновый аналог NAD+, связанный в 6-положенне (заштрихованные
части слева представляют матрицу сефарозы 4В).
214
Глава 8
Д
?
NH-CHj-CHj-CHj-СНг-С Ht-С Ht-NH-
он о <рн
NH-CHj-CH-CHj-NH-C-CHj-NH-CHj-CH-CHj-NH-
он
l-NH-CHj-СН-CHj-NH~_
О __
V-N=n-NAD +
(связанный е в ¦ положение)
Ж |-МН-СНг'СНг-СНг-СН,-СНг-СНг-НН-Л 0
рц I -c-chj-s- везаминоньо *
nh-ch.-ch-ch.-nh-J (связанный
в 6-положение)
Нижеприведенная схема синтеза гидрофильной пространственной группы взята
из той же работы
Сефароза 4 В
1,3-Виатнолротш-г
, он
rNH-CHj-CH-CHj-NHj
jf бромацетлирование)
он
I
(,3-йиаминопропанол-1
он
он
-NH-CHj-Сн-СН2-NH-C-CHf-NH-CHj-?н-CHt-NH,
^брохацетлирование)
он о он о
-МН-СН?-СН-CHj-NH-С-CHj-NH-CHj-СИ-CHj-NH-Й-CHjBr
В большинстве случаев гидрофобный характер пространственных групп
приводит к значительным осложнениям из-за возникновения неспецифических
гидрофобных взаимодействий, и, следовательно, желательно избегать
использования таких пространственных групп, отдавая предпочтение
пространственным группам с гидрофильными свойствами.
Другие методы включейия гидрофильных пространственных групп уже
упоминались в разд. 8.2.4 при рассмотрении связыва-
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда____________215
ния с ломошью бисоксиранов. Примерами гидрофильных 'пространственных
групп могут служить также олиголептидные цепа
9 °
Ц-NH-CHg- С- NH-CHj-C- N H-CHj-COOH
1
я О О соон
I -NH-сн4-с- nh-сн,-с-nh-снГ | сн^и^он
I ° и /ООН
^ -NH-CHf-C-NH-CHj-C-NH-CH( f е CHjSH
В разд. 8.2.4 обсуждалась проблема освобождения алкиламин-ных
пространственных групп, связанных с активированной бромцианом агарозой;
эта проблема рассматривается также далее в разд. 8.5. Для предотвращения
десорбции лигандов со специфических сорбентов лучше всего использовать
многозарядные пространственные группы [89-92]. Устойчивые производные
агарозы с высокой емкостью можно получить путем присоединения поли-лнзнна
или мульти-поли-d, ь-аланилполилнзина к сефарозе, активированной
бромцианом. К недостаткам получаемых таким образом производных относятся
их ионообменные свойства, однако такие свойства отсутствуют при
связывании на активированной бромцианом сефарозе гидразидои.
Присоединенная к носителю пространственная группа характеризуется низким
значением рК (4,2), поэтому сорбент не обладает ионообменными свойствами
в Нейтральных и щелочных средах.
t
{Получение полиакрилгидразнд-агарозы
