Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
прикрепленным через пространственную и др. [43], эстрадиола -
группу цикло-АМР в зависимости от време- Сикой и до. Г661. а е-ДНФ-
фарозой и стеклом, а Вокелен и др. [81]-десорбцию изопроте-ренола,
связанного с агарозой.
Отщеплеиние связанных лигандов можно уменьшить, если использовать
связывание через полифункциональные пространственные группы (разд. 8.3).
Снизить десорбцию, кроме того, можно, если для связывания использовать
реакции, увеличивающие прочность связи аффинного лиганда с носителем, а
именно при использовании метода периодатного окисления или метода
присоединения к эпоксиактивированной агарозе. Парих и др. [52] изучили
изменение степени десорбции в зависимости от используемого носителя. При
выделении рецепторов эюстрогена и инсулина невозможно применить,
например, стекло и полиакриламидные носители из-за исключительно быстрой
десорбции аффинных лигандов.
7- 10г
• /
¦ з
so 90 /го
Время,мин
ния к поверхности нерастворимого носителя и что она может быть усилена в
полиакриламидных гелях анхимерным влиянием соседних карбоксильных и
амидных групп, а в агарозе, целлюлозе и сшитых декстринах - гидроксильных
групп. Реакция освобождения не зависит от структуры связанного аффинного
лиганда. Аффинные лиганды, связанные с полиакриламидными гелями связями
типа R-NH-СО-ак-риламидный гель, отщепляются медленнее. Десорбция
дезоксикортикостероидов и эстриолов из конъюгатов с
минов и пропанола из их химических соединений с се-
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
221
Математический подход к десорбции лиганда в аффинной хроматографии [25]
Гидролитическое расщепление множественных связей молекулы связанного
лиганда с матрицей можно описать процессом, состоящим из последовательных
реакций. Если допустить, что кинетика этих реакций подчиняется
псевдопервому порядку, что согласуется с предложенным механизмом
десорбции, и константы последовательных реакций имеют одно и то же
значение, то можно вывести выражение для концентрации свободных лигандов
Сn. Если известна общая концентрация фиксированного лиганда, т. е.
содержание (в мкмолях) в 1 мл влажного геля, то
а=СА+Св-Н • ¦ • +CN.
Разрыв связей описывается соответствующими уравнениями. Для первой связи
(А->-В)
dCA/CA--k J dt -* Сд =аегы. {8.1)
для второй связи (В -> С)
dCB/dt=kCA-kCB=kae~kt-kCB
или
dCBldt+kCB=kae-kt.
Решение этого дифференциального уравнения и аналогичных уравнений для
реакции C-"-D, D-*-E и т. д. по методу Теорелла
приводит к
СА=ае'к1=а Съ=Ше-к*=аЩ?-е-",
с"=4- е~к'-
Комбинация этих уравнений с уравнением (8.1) приводит к выражению
(8.2)
р=О
Для каждого п можно построить зависимость Cn/я от kt. Для значений л от 1
до 6 результаты приведены на рис. 8.7. Видно, что при л>1 между началом
реакций отщепления и появления первых свободных молекул лиганда имеется
индукционный пери-
-dCA/dt=kCA -- Г
222
Глава 8
од. Этот период увеличивается с возрастанием л и с уменьшением k. Из
уравнения (8.2) можно определить время половинной десорбции (т), если
положить Сц равной а/2
"-"S^TT-T- <8-3>
Поскольку это уравнение трансцендентальное, для него нельзя получить
точного аналитического решения. Результаты графиче-
Рис. 8,7. Зависимость См/а от kt для n=-1.6 [уравнение (8.2)1 Г25].
ского решения представлены в табл. 8.8. Достаточно быстро можно получить
решение этого уравнения при помощи метода Ньютона- Рафсона, причем
получается решение в форме, удобной для практического использования. Вот
допустимое приблизительное общее решение
[(л - l)+ln2|/ft. (8.4)
Можно также вычислить значение индукционного периода, упомянутого выше.
Путем подстановки выбранных величин Cn/й и л в программу ЭВМ найдены
значения kt (табл. 8,9). В соответствии с ожиданиями при постоянном п
наблюдается уменьшение М при увеличении отношения С^/а и увеличение kt
при росте л и постоянстве Сц/а. Интересно, что при росте п разность между
kt и См/а для крайних случаев уменьшается. Замена одноточечно связанного
лиганда на двухточечный приводит к более значительному эффекту, чем,
например, изменение л от 5 до 10.
Из экспериментальных результатов можно рассчитать константу скорости
десорбции. При pH 8 и комнатной температуре она равна 0,25-Ю-4 мин-1. Это
значение, а также данные табл. 8.9
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда____________223
позволяют сделать вывод, что через 2-3 с концентрация молекул свободного
лиганда во влажном геле составит 2 пмоль/мл при первоначальном
одноточечном связывании 2 мкмоль/мл. Порядок экспериментальной константы
скорости десорбции согласуется с величинами, найденными ранее. При
постоянном значении k упомянутое выше время 2-3 с превращается (r) I ч
(п=2), 5 дней (л=5) и 5-6 недель (л =10). Эта тенденция согласуется с
наблюдениями Вильчека [89].
Тени [76] вывел, что времена половинной десорбции и временную зависимость
количеств освобожденного лиганда можно удобно рассчитать из табличных
значений х2. пользуясь хорошо известными соотношениями между кумулятивной
