Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
помощью тиол-дисуль-фидного обмена. Методика включает две стадии: а)
тиолирова-ние ферментов метил-3-меркаптопропиоимидатом и б) связывание
тиолированных ферментов со смешанными дисульфидными производными агарозы,
полученными при .взаимодействии меркаптоок-силропилового эфира агарозы с
г^'-дилиридилдисульфидом. Полученные препараты иммобилизованных ферментов
обладали высокой активностью. Иммобилизованная а-амилаза была применена
для непрерывного гидролиза крахмала. Когда препарат терял свою
ферментативную активность, неактивный белок удаляли восстановлением
дисульфидных связей и гель повторно использовали для связывания свежей
активной тиолированной "-амилазы.
Обогащение фермента тиольньши группами. 30 мг фермента растворяют в 5 мл
0,1 М бикарбоната натрия (pH 8,2). Раствор деаэрируют в атмосфере азота в
течение 15 мин; добавляют 0,1-2 мг метил-З-меркаптопропиоимидата.
Тнолнрованне проводят при комнатной температуре в токе азота в течение 60
мин. Избыток имидата удаляют гель-фильтрацией через сефадекс G-25, в
Качестве элюента используют 0,1 М бикарбонат натрия. Для предотвращения
окисления тиолированных ферментов в раствор сразу же после гель-
фнльтрации вводят дитиотректол (до концентрации 1 ммоль/л).
Активирование тиол-сефарозы по Броклехурсту и др. [6].
Эпоксиактивированную агарозу (50 г) промывают на стеклянном фильтре 0,5 М
фосфатным бу-
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
197
¦фером (4,1 г NaHjPO"-HiO+2,8 г Na2HPC>4-2HaO на 100 мл дистиллированной
'.и'оды, pH 6,3), Гель отсасывают на воронке для удаления буфера,
находящего-'.ся в порах геля, и суспендируют в том же буфере; конечный
объем суспензии -100 мл. После прибавления 2 М тиосульфата натрия (50 мл)
реакционную смесь •зстряхивают 6 ч при комнатной температуре. Гель
отмывают от тиосульфата -натрия дистиллированной водой. Тиосульфатнын
эфир геля (50 -г) суспендируют в растворе 0,1 М бикарбоната натрия
(содержащего I ммоль/л ЭДТА); общий объем суспензии 100 мл. К суспензии
прибавляют дитиотрентол (60 мг), растворенный в 4 мл 1 мМ ЭДТА. При
комнатной температуре реакция продолжается 30 мин. Гель промывают на
стеклянном фильтре 0,1 М бикарбонатом натрия (содержащим 1 моль/л хлорида
натрия и 1 ммоль/л ЭДТА) и, наконец, 1 мМ ЭДТА. Отмытый гель быстро
добавляют к 200 мл 1,5 мМ. 2,2'-дипяридилдясуль-фида (в 0,1 М бикарбонате
натрия). Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин при
постоянном перемешивании. Продукт промывают 0,1 М бикарбонатом натрия, 1
М хлоридом натрия, а затем 1 мМ ЭДТА. Степень замещения рассчитывают по
данным определения азота по Кьельдалю. Продукт- активированная тиол-
агароза - при хранении устойчив.
Связывание тиолированного фермента. 1-20 мг тиолироаанного фермента в 10
мл 0,1 М бикарбоната натрия смешивают с 3,0 мл седиментированной
активированной тнол-агарозы (предварительно промытой 0,1 М бикарбонатом
натрия); реакцию проводят при 23 °С в течение 24 ч при постоянном
перемешивании. Конъюгат промывают на воронке со стеклянным фильтром 100
мл 0,1 М бикарбоната натрия, переносят в колонку, через которую были
пропущены (со скоростью потока 10 мл/ч) следующие растворы: 1) 0,1 М
бикарбонат натрия, содержащий ОД моль/л хлорида натрия (24 ч); 2) ОД
М ацетат натрия
(pH 5,4), содержащий ОД моль/л хлорида натрия (24 ч); 3) ОД М хлорид
натрия (24 ч).
. Инактивированный фермент удаляют с носителя в колонке (объем колонок
0,5 мл) промыванием (скорость потока 20 мл/ч) 50 мл 20 мМ днтнотреитола
(в 0,1 М бикарбонате натрия). Восстановленный носитель промывают 150 мл 1
М. хлорида натрия и активируют пропусканием 100 мл 1,5 мМ 2.2'-дипири-
дклдисульфида (в 0,1 М бикарбонате натрия). Активированный тнолсодержащий
гель промывают 100 мл 1 М хлорида натрия и 100 мл 0,1 М бикарбоната
натрия и повторно используют для иммобилизации новой тиольной системы.
Наряду с описанными выше для связывания аффинных лигандов с агарозой
используется также триазиновый метод. Первоначально он был разработан
Кеем и Лилли [33] для связывания аффинных лигандов с целлюлозой {разд.
8.2.1) с помощью 2-ами-но-4,6-дихлор-ашж-триазина.
Присоединение аффинных лигандов с помощью N-оксисукцнмнмидных эфиров
агарозы
Куатреказас и Парих [15] описали приготовление N-оксисук-цинимидных
эфиров сукцинилированных аминоалкильных производных агарозы. Эти активные
эфирные производные агарозы при хранении в диоксане устойчивы в течение
нескольких месяцев. Они очень быстро образуют стабильные амидные связи
(при 4°С) с непротонированными формами первичных алифатических или
ароматических аминогрупп при pH 6-9. Из функциональных групп
исследованных аминокислот только сульфгидрильные эф-
198
Глава 8
фективно конкурируют с аминогруппами в реакции связывания. Реакция
протекает по следующей схеме:
Агароза \~сн
^-NHCHjCHjCHjNHCHjCHgCHjNH^ + О I |
|~NHCH,CH4CH jNHCHjCHjC HjNHCOCHjCH jCOOH a
даоксан + N'N" дщимогексиянарлдиимад N-он - сукцвнимид
