Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
В ряде гелей в-аминокапроновую кислоту связывали в различных условиях и
определяли ее количество титрованием или по содержанию азота. .Во всех
случаях при действии бромциана включалось больше азота, чем можно было бы
ожидать из содержания связанной е-аминокапроновой кислоты, определенной
титрованием; включение превышало расчет в отношении от 3:1 до 9:1.
Превышение включения азота против расчетного возрастало с увеличением
температуры активации (при 2''С оно составляло 3,3 раза, при 4°С-4,9
раза, а при 20°С-8,3 раза). Поскольку при 2°С активация протекает очень
медленно, такие условия нельзя использовать на практике. При 10°С
наилучшим образом сочетаются достаточно высокая скорость активации и
минимальное число побочных процессов. Побочные реакции, сопровождаемые
повышением содержания азота в препаратах иммобилизованных лигандов,
являются одним из источников катионных групп, которые приводят к
неспецифической сорбции. Этот вопрос детально обсуждается в разд. 10.3.
Лоу и Дин [41] отмечали, что активированные гели содержат хотя и в
небольших, ио существенных количествах бром, что можно объяснить
присутствием в препаратах бромциана трибромтриазина, который может
участвовать в реакции связывания.
Другим источником неспецифической сорбции агарозой является сера [35],
которая может быть почти полностью удалена щелочной десульфуризацией в
присутствии борогидрида натрия с последующим восстановлением
алюмотидридом лития в диоксане. Влияние уменьшения содержания серы в
различных препаратах агарозы на адсорбционную емкость по цитохрому с
описано По-ратом и др. [56].
Присоединение аффинных лигандов к агарозе с помощью бифункциональных
оксиранов [71]
Бисоксираны (например, диглицидильный эфир бутандиола-1,4) были
использованы для введения в агарозу реакционноспособ-
Нерастворимые носители и методы иммобилизации лиганда
195
|Ых оксирановых группировок. Последние могут далее реагировать с амино-,
окси- и тиолсодержащими соединениями
|он + с^г~СН- CHj-O-{CHjJi4-0-CHj-CH -СНг *¦
* о Ъ
* |-о"снГ?н_снг~о_(сн*^-0-сн1--сн-снг + H.N-R ->
он Nor
*¦ |~0~CHrfH-CH2-o-(CHzV-0-CH2_<fH-CHrNH-R
он
I
он
Метод пригоден для связывания сахаров, которые образуют эфирные овязи по
своим гидроксильным группам. Белки и пептиды своими первичными
аминогруппами образуют алкиламинные связи, С веществами, которые содержат
тиольные группы, образуются тиоэфирные связи. Когда используется 1,'4-
бис(2,3-эпокси-пропокси) бутан, то между лигандом и цепью агарозы
вводится пространственная группа, соответствующая цепи из 12 углеродных
атомов. Под действием бисоксирана происходит поперечное сшивание
углеводных цепей матрицы геля, которое повышает ее устойчивость. Это
позволяет применять более жесткие условия для связывания и элюирования.
Эти гели поступают в продажу под названием эпоксиактивированной сефарозы.
Активация, поперечное сшивание и связывание
1 г подсушенной при отсасывании агарозы (сефароза 6В) промывают водой на
воронке со стеклянным фильтром, а затем смешивают с 1 мл диглици-дилового
эфира и 1 мл 0,6 М едкого натра, содержащего 2 мг/мл борогидрида натрия.
Суспензию перемешивают (вращением) при 25 °С в течение 8 ч, затем реакцию
останавливают; гель промывают большим объемом воды (500 мл) иа воронке со
стеклянным фильтром. Связывание проводят, смешивая 1 г подсушенной
отсасыванием оксиран-агарозы с 2 мл раствора вещества, подлежащего
иммобилизации, в буфере с требуемым pH. Белки связываются при pH 8,5->10-
'ш температуре 25 еС, продолжительность реакции 15-48 ч.
Связывание аминокислот, аминов, углеводов и других более или менее
устойчивых соединений можно проводить при pH 9-11, 25-75°С, с
продолжительностью реакции 4--15 ч. Увеличить выход в реакции связывания
можно, повысив pH и температуру реакции.
Уменьшение выхода для связывания белков при низких pH и температуре?
можно компенсировать увеличением продолжительности реакции. Остающиеся
оксирановые группы, способные к дальнейшему связыванию, блокируются,
например, 24-часовой обработкой 2 М глицином или 2-аминсэтанолом,
предпочтительно при pH >8,5 и температуре 23 °С. Наряду с водными
растворами, можно работать в присутствии также органических
растворителей, таких, как днметилформа-мид или диоксэн (содержание их в
конечной смеси должно соответствовать 50%),
Сложноэфирные н алкиламинные связи очень устойчивы, как это следует из
рис. 8.3, где показана стабильность глициллейци-
13*
196
Глава 8
на, присоединенного к эпоксиактивированной сефарозе 6В, при 70 °С и pH 3,
7, 11 и 13.
Рис. 8.3. Устойчивость при 70 °С глициллейцина, присоединенного к
эпоксиактн-вированной сефарозе 6В [96].
Обратимая ковалеитиая иммобилизация ферментов с помощью тиол-
дисульфндиого обмена [6]
Карлсон и др. [8] использовали эпоксиактивированную агарозу в качестве
основы для приготовления меркаптооксипропилового эфира агарозы, хоторую
они применили для ковалентной иммобилизации а-амилазы и химотрипсина с
