Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
гидрофобные области на поверхности своих молекул, благодаря чему они
способны связываться с гидрофобной
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
69
пространственной группой, такой, как гексаметилендиамин или t-
аминокапроновой кислотой. Это явление использовано для разделения ряда
биологических макромолекул; метод известен как гидрофобная (аффинная)
хроматография, которая детально рассмотрена в гл. 7.
Поскольку структура выделяемых веществ различна, нельзя дать общих
рекомендаций относительно минимального расстояния
Рис, 5.4. Аффинная хроматография а-химотрипсина на колонках сефа-розы с
ингибитором [5].
Колонки (50x5 мм) предварительно уравновешивались 0,05 М трнс-НСЬбу-фером
|рН 8,0). Образец (2,5 иг) нано сился в 0,5 мл того же буферного рае
твора. Колонки элюировались при ком иатной температуре, скорость потока
40 мл ч; объем фракции 1 мл. Стрелки указывают замену элюента на 0,1 М
уксусную кислоту (pH 3,0). л-сефэроза с присоединенным метиловым эфиром с
амннокапронил-О'Трнп-тофака; б - сефароза с присоединен ным метиловым
эфиром D-триптофаиа; е - иемодифиинрованная сефероза. Псрвые пики на рис.
я и б не обладали ферментативной активностью.
Объем элюирования, мл
между аффииантом и поверхностью нерастворимого носителя. Однако аффинант
должен располагаться на таком расстоянии от поверхности носителя, чтобы
связь его с носителем не требовала деформации выделяемого вещества.
Влияние удаленности аффинанта 3'-(4-аминофенилфосфорил)дезокснтимидин-5/-
фосфата от поверхности нерастворимого носителя (сефарозь: 4В и бногеля Р-
300) на емкость геля при хроматографии стафилококковой нук-леаз5.1
показано в табл. 5.1 И]- Связь ингибитора непосредственно с матрицей
обозначена как тип А, если же между ингибитором и поверхностью носителя
введены цепи различной длины, то такие связи отнесены еще к трем типам
(Б, В, Г).
Хипуэлл и др. [10] провели хроматографию нескольких дегидрогеназ на Х6-
а)-амнноалкил-АМР - сефарозе. По концентрации хлорида калия, необходимой
для освобождения дегидрогеназы из комплекса с нуклеотидом, может быть
определена сила взаимодействия, оцениваемая как связываемость р. Влияние
длины пространственной "ножки" на связываемость р некоторых дегидрогеназ
на Ы6-со-аминоалкил-АМР-сефарозе иллюстрирует рис. 5.5. Связываемость р
двух изоферментов лактатдегидрогеназ быстро возрастает отп = 2кп = 5 (где
п - число СНг-групп в "ножке").
Sfi
= 0 8
* Ifi 00
70
Глава 5
Таблица 5.1
Емкость нерастворимых аффинантов, приготовленных путем присоединения 3'-
(4-амииофенилфосфорил)дезокситимидин-5'-фосфата к производным сефарозы 4В
и биогеля Р-300, в аффинной хроматографии стафилококковой пуклеазы
вея
5 ** = л з о. "в *-
_ Ж (Ч
Н 5 V
Струнтура
Емкость (в мг нуклеа-зы на 1 мл геля) произ водных
сефарозы
4В
I
- Р 04-^Р о?~
О Т
-NHCh^CH^HCCHiNH-^VpO,,-
О О СООН -MHCHjCNHCHjCNHCHCMj
фЬМ=^Ро4--i**-он т
О О j
kNHCH^CHjCHjNHCHjCHjCHjNHCCh^CHjCNH-^' Vpo4-фро;
бйоГеЛЯ
Р-300
0,6
2
Если пространственная "ножка" еще более удлиняется, элюирование может
быть усилено ударным введением небольших количеств NADH. Связывание
малатдегидрогеназы. п-глюкозо-б-фосфатде-гидрогеназы и D-глицеральдегид-
З-фосфатдегидрогеназы значительно слабее, чем лактатдегидрогеназы. Тем не
менее для полимерных "ножек" с числом СНг-групп п>7 незаметно, чтобы
связывание фермента существенно изменялось. Кроме того, из рис. 5.5
очевидно, что для связывания лактатдегидрогеназы на иммобилизованном
нуклеотиде в пространственной группе необходимы по крайней мере четыре
метиленовых звена. Установлено, что использование протяженной "ножки"
длиной по крайней мере 0,5 нм достаточно, чтобы преодолеть барьер,
воздвигаемый микроокружением, создаваемым гидрофильным полимером [20].
Наличие такого барьера может быть обусловлено упорядоченным слоем молекул
воды, окружающих скелет матрицы, и ограниченной диффузией в эту область
или колебательными движениями решетки. В любом случае слой растворителя
вблизи поверхности нерастворимого носителя представляет собой реальный
барьер для взаимодействия макромолекулы с комплементарным аффинным
лигандом, в особенности если взаимодействие проявляет слабую аффинность.
Общие вопросы связывания на аффинном, сорбенте
71
Однако из упоминаемых выше экспериментов все же не следует, что только
расстояние аффинанта от матрицы - решающий, фактор, определяющий силу
связывания. Изучая гидрофобные пространственные группы О'Карра и др. [25-
27] показали, что во многих случаях сорбция более зависит от гидрофобного
связывания выделяемого вещества гидрофобной цепью, чем от образования
биоспецифического комплекса. В качестве одного из наиболее часто
цитируемого в статьях о влиянии пространственных групп примера,
относящегося к аффинной хроматографии р-галак-тозидазы на носителях [31].
можно рассмотреть следующие сорбенты:
Агароза. q q . снаон
$-NHCH2CHaCHaNHCHaCH2CHaNHCCHgCHaCNH-/^V-S-i/0^A
ОН
Аффинный сорбент А, приготовленный путем привязки ингибитора - и-
