Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
киназ и дегидрогеназ показано исследованиями Гарвея и др. [8]. Сорбент
Ы6-(6-аминогексил-)-АМР - сефароза содержит АМР, привязанную к сефарозе
Ы6-аде-ниновой частью,
он он
74
Глава 5
в то время как в сорбенте Р1-(6-аминогексил)-Р2-(5/-адепоз1ш)пи-рофосфат
- сефарозе АМР присоединена посредством б'-фосфата:
О связывании различных дегидрогеназ и киназ на этих двух сорбентах
упоминалось в предшествующей главе (табл. 4.2). Глю-козо-6-
фосфатдегидрогеназа, D-глицеральдегид-З-фосфатдегидро-геназа и миокиназа
связывались только Р'^б-аминогексилЬР2-(б'-аденозип) пирофосфат-
сефарозой, в то время как алкоголь-дегидрогеназа и глииерокиназа
связывались только Ы6-(6-амино-гексил)-5'-АМР - сефарозой.
Лактатдегидрогеиаза, малатдегидро-геназа, 3-фосфоглицераткиназа и
пируваткиназа связывались обоими сорбентами, а гексокиназа и
креатинкиназа не связывались ни одним из них. Эти результаты отражают
природу фермент-нук-леотидных взаимодействий; можно сделать вывод, что в
то время как свободная б'-фосфатиая группа существенна для связывания,
например, алкогольдегидрогеназы или глицерокиназы, она играет совершенно
другую роль при взаимодействии с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой. В
этом случае решающая роль принадлежит аденозиновой части аффинанта.
Наиболее жесткие требования к связыванию гексокиназы и креатинкиназы
приводят к тому, что эти ферменты не присоединяются ни к одному из этих
сорбентов.
Высокомолекулярные аффинные лиганды обычно открывают больше возможностей
для приготовления аффинных сорбентов. Ряд очень активных аффинных
сорбентов получен при прямом присоединении белка к нерастворимому
носителю (многочисленные примеры приведены в гл. 11, табл. 11.1). Однако
в этом случае очень важным является условие, чтобы присоединение белка к
нерастворимому носителю не приводило к изменению его нативной
конформации.
В качестве иллюстрации рассмотрим пример иммуноадсорбции. Куатреказас [4]
выделял инсулин на колонках с сефарозой, содержащей антитела против
свиного инсулина, привязанных при pH 6,5 и 9.5. Как показано в разд.
8.2.4, белок привязывается к активированной бромцианом сефарозе
аминогруппами в непрото-нированной форме. При понижении pH происходит
также уменьшение числа связывающихся групп. Различие в pH привязки бел-
Общие вопроси связывания на аффинном сорбенте
75
ка привело к тому, что в первой колонке (pH 6,5) связывалось почти 80%
теоретически возможного количества инсулина, в то-время как во второй
колонке (pH 9,5) сохранялось только 7% сорбционной емкости по инсулину,
Поскольку общее содержание привязанного аффинанта одинаково в обоих
колонках, во второй должен находиться иммуноглобулин, неспособный
эффективно связывать антиген. При большом числе привязанных аминогрупп,
очевидно, происходит нарушение нативной третичной структуры. Даже при
низких pH могут быть получены сорбенты, содержащие достаточно много
активного белка, присоединенного к сефарозе, если увеличить количество
бромциана при активации носителя и количество белка при его привязке.
5.3. КОНЦЕНТРАЦИЯ АФФИНАНТА НА МАТРИЦЕ
Теоретически выведенная взаимосвязь между количеством сорбируемого
фермента, концентрацией аффинного лиганда и константами равновесия лиганд
- фермент рассмотрена в гл. 3. Из рис. 3.3 следует, что для систем с
низким сродством (Kl = = 10_3 моль/л) концентрация привязанного аффинного
лиганда представляет собой критический параметр для получения
эффективного сорбента. На рис. 5.6 показана аффинная хроматография
глюкокиназы на 2-амино-2-дезокси- о-глюкопиранозо-]Ч-(6-амино-гексаноил)
-сефарозе при четырех концентрациях связанного аффинанта [15]. Видно, что
оптимальная концентрация аффинного лиганда равна 3,75 мкмодь/г (рис.
5.6,6): при более низких концентрациях фермент не отделяется от
неактивного материала, в то время как при более высоких концентрациях
необходимо увеличить концентрацию глюкозы в элюате и при этом глюкокиназа
выходит в большем объеме элюата, При концентрации 10 мкмоль/г глюкокиназа
не может быть элюирована даже при высоких концентрациях глюкозы; она
может быть снята только пропусканием 0,5 М хлорида калия.
Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная
хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N6-
(6-аминогексил)-5'-АМР - сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда
(1,5 мкмоль 5'-АМР в 1 мл) для элюирования фермента необходимо введение
NADH ("удар"). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5'-АМР в 1 мл)
десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от 0 до 1
моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного
лиганда (0,025 мкмоль 5'-АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению
доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным "уравновешивающим" буфером
даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время
76
Глава 5
белок, обладающий ферментативной активностью, незначительно отставал в
