Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
аминофенил-р- d -тиогалактопиранозы - непосредственно к сефарозе, не
связывает и не задерживает фермент в заметной степени. Прикрепление
ингибитора через короткую "ножку" (~ !0 А) дает сорбент Б, который очень
мало задерживает фермент во время его пропускания через колонку. Для
освобождения фермента из комплекса нет необходимости в изменении состава
буферного раствора, и фермент выходит из колонки сразу же за неактивным
белком. Только когда между ингибитором и поверхностью носителя помещена
длинная "ножка" (~21 А), образующийся сорбент В способен сильно
связывать р-галак-
тозидазу из различных бактериальных источников. Элюи-
рование фермента происходит только после замены буферного раствора. Этот
сорбент часто приводится в качестве примера очень эффективного
специфического сорбента, приготовленного из ингибитора с относительно
высокой константой ингибирования (5• 10-3 моль/л) при относительно низкой
концентрации аффинанта (0,6 ммоль/л). О'Карра и др. [26] приготовили
сорбенты, ана-
72
Глава 5
Рис. 5.5. Влияние длины пространственнин "нижки" на спязываемость
некоторых дегидрогеназ на Ыв-о)-аминоалкпл-АМР-сефарозе [10].
Колонки с модифицированными гелями (50X5 мм) предварительно
уравновешивались при 4 °С 10 мМ. буфером (КН?Р04+К0П, pH 7,5), содержащим
0,02% азида натрия. Объем об-разца фермент - белок, наносимого на
колонку, равен объему колонки; после нанесения образца колонка
промывалась несколькими объемами уравновешивающего буфера в линейном
градиенте концентрации КС) (от 0 до 1,0 моль/л; общий объем элюата 20 МЛ)
С последующим "ударом" 200 мкл 5 мМ. NADH, наносимого на колонку так же.
как и смесь фермент - белок. Скорость потока 8,0-10,0 мл ч; объем фракции
1,4 мл.
/ -- 4 Е лактатдегидрогеназы Н<; 2 - 4Е лактатдепырогеназы-М*; 3- 2Е
0*ГЛЮКОЗо-6-фос-фатдегидрогенаэы; 4 -4Е малатдегидрогейазы; ¦> - 2,5 Е О
глиЦСральдегнд;3-фосфатдегид
рогенааы.
логичные сорбенту В, в котором они заменили специфический ингибитор (р-
тиогалактозид) неспецифическим (а-глюкозидом или N-фенилглииином). Оба
сорбента сохранили сильное сродство к р-галактозидазе. Но если
использовалась гидрофильная цепь
л он о он
я- N Н-с н4-С н-снг- NH-с-сн?- nh-ch2- <!:Н- СНа-NH?
в качестве пространственной группы для привязки р-тиогалактози-да,
сорбция р-галактозидазы на таком сорбенте не была такой же сильной.
Следовательно, сорбция р-галактозидазы на производном В определяется
главным образом гидрофобными взаимодействиями с пространственной
"ножкой". Гидрофобная природа этой пространственной группы, а также
слабое влияние высоких концентраций солей также подтверждают эту точку
зрения.
Мешающее влияние неспецифической сорбции в биоаффинной хроматографии
обсуждается подробно в разд. 5.8 и 10.3. Неспе-цифической сорбции можно
лучше всего избежать, если использовать гидрофильные пространственные
группы, получение которых описано в разд. 8.3.
Гидрофильные пространственные группы предотвращают также и другие
нежелательные последствия, имеющие место, когда
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
73
гидрофобный аффинант привязан к длинной подвижной гидрофобной цепи. При
этом аффинант сам может взаимодействовать с пространственной группой и
маскируется или окклюзируется гидрофобным окружением. Такая
"конформационная окклюзия" может быть причиной недоступности
иммобилизованного аффинанта для комплексообразования с выделяемым
веществом. Практическим примером этого является аффинная хроматография
транс-N-дезоксирибозилазы [13]. На сефарозе с иммобилизованным М6-л-
амино-к-гексиладенином показано, что подвижность цепи обусловливает
тесный контакт активной части лиганда с нерастворимым носителем и поэтому
эффективное взаимодействие с ферментом не может осуществляться.
5.2. КОНФОРМАЦИЯ ПРИСОЕДИНЕННОГО АФФИНАНТА
Специфические взаимодействия биологических макромолекул основаны на
комплементарности связывающих участков. Например, высокая реакционная
способность специфических субстратов обусловлена наиболее благоприятной
конфигурационной и кон-формационной ориентацией групп субстрата
относительно комплементарно расположенных групп или центров фермента.
Таким образом, чем сильнее взаимодействие субстрата и ингибитора с
ферментом, тем выше комплементарность связывающих участков. Это
справедливо не только в отношении пространственного расположения, но
также и в отношении природы комп-лементирующнх частей молекул. Однако
способы привязки аффинного лиганда к нерастворимому носителю в
значительной степени ограничены, потому что лиганд должен быть привязан
той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании. Кроме
того, иммобилизация аффинанта не должна приводить к изменению его
конформации или отрицательно влиять на природу его связывающих участков.
Эффективность аффинного сорбента зависит от степени, до которой эти
требования выполняются.
Существенное значение способа присоединения нуклеотидов к нерастворимому
носителю для эффективности хроматографии зависимых от пиридиннуклеотида
