Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 20

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 198 >> Следующая

54
Глава 4
в растворе в тех же условиях по ингибированию ферментативного гидролиза
n-нитроанилида бензоил-ь-аргинина по Диксону [5], равна 0,17 ммоль/л.
Небольшие различия могли возникнуть в результате использования условий,
оптимальных для сорбции, но менее подходящих для кинетического анализа.
Используя описанный метод, Касаи и Ишии [10] определили Ki для различных
ингибиторов. Для а- и (3-трипсинов и трипсина из Stseptomyces griseus
определены К\ на сефарозе со связанным глицилглицил-ь-аргинином; для [3-
трипсина изучено также влияние на Kl различных концентраций солей.
Поскольку нет никаких данных о коэффициентах активности f, их значения
были приняты равными единице.
Преимуществами метода Касаи и Ишии [10] являются его чувствительность и
простота: для исследования необходимо лишь небольшое количество белка; по
сравнению с методом Данна и Чейкена [7] в этом методе концентрация
фермента очень мала относительно Kl; использование фронтального анализа
упрощает выведенные уравнения; объемы элюирования можно определить более
точно, поскольку они практически не зависят от концентрации. При
использовании этого метода для определения констант диссоциации
химотрипсина на сфероне. к которому был привязан с помощью гидрофобного
гексаметилендиамина N-бензилоксикар-бонилглицил- D-фенилаланин, Туркова и
др. [15] встретились с трудностями, обусловленными, очевидно,
неспецифической сорбцией.
Для трипсина описанным методом на колонке со сфероном, к которому
присоединен через гексаметилендиамин п-аминобензами-дин, определены Ki,
которые оказались равными: для бензоил-ь-аргинина 5,5-10_3 моль/л, н-
бутпламина 3,7-10-3 моль/л, бензил-амина 5,0-10-4 моль/л, бензамидина
5,3-10-5 моль/л и л-амино-бензамидина 1,9¦ 10-5 моль/л. Найденные по
методу Данна и Чей-кена [7] значения Ki для трипсина па такой же колонке
равны; для бензоил-ь-аргинина 5,3-10 3 моль/л, н-бутиламина
1.7-l(h3 моль/л, бензиламина 3,1-10-4 моль/л, бензамидина
6.7-10-5 моль/л и п-аминобензамидина 1,9-10-5 моль/л. Эти величины хорошо
согласуются с вычисленными из кинетических данных. Для иммобилизованного
n-амипобензамидина Kl равна
3.7-Ю^6 моль/л по методу Касаи и Ишии [10] и 1,9-10~6 моль/л по методу
Данпа и Чейкена [7]. Зависимости 1/(1/,--К0) от 1/К; (метод Данна и
Чейкена [7]) и К; от Ki(V-V{) (метод Касаи и Ишии [10]) для различных
ингибиторов в идентичных концентрациях линейны. Следовательно, если
имеется колонка с иммобилизованным ингибитором и по значениям К;
известных ингибиторов определен тангенс угла наклона кривой, то для
неизвестных ингибиторов К; можно найти после измерения соответствующих
объемов элюирования [15].
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 55
4.3, КООПЕРАТИВНОЕ ЭЛЮИРОВАНИЕ ОЛИГОАДЕНИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В ХРОМАТОГРАФИИ
НА ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПОЛИУРИДИЛОВОЙ
КИСЛОТЕ [13]*
Анализ кривых элюирования макромолекул, специфически сорбируемых на
аффинном сорбенте, является потенциальным аналитическим методом для
изучения специфических взаимодействий биополимеров. Кривые элюирования
очень близки к изотермам связывания элюируемого вещества с
иммобилизованным аффи-нантом, и, следовательно, из хроматограммы можно
получить термодинамические параметры молекулярных взаимодействий. Метод
эквивалентен повторяющемуся диализу и имеет много преимуществ по
сравнению с обычным равновесным диализом. Например, он требует намного
более низких концентраций и небольших количеств образца, несколько
образцов разных молекул можно наносить одновременно и обнаруживать
небольшие различия в связывающих способностях при хорошем разделении.
Метод анализа кривых элюирования применен в колоночной хроматографии
олигоадениловой кислоты на агарозе со связанной полиуридиловой кислотой
при нескольких температурах и концентрациях олигоадениловой кислоты.
Теория кооперативного связывания олигонуклеотидов с полинуклеотидом была
расширена таким образом, что эта хроматографическая система может быть
описана теорией теоретических тарелок, как упоминалось в разд. 3,2.
Связывание олигоадениловой кислоты с полиуридиловой кислотой носит
кооперативный характер, и стабильность комплекса зависит от температуры и
концентрации олигоадениловой кислоты. Следовательно, характер кривых
элюирования олигоадениловой кислоты, хроматографируемой на агарозе с
иммобилизованной полиуридиловой кислотой, зависит от концентрации олиго-
адениловой кислоты и температуры, как это следует из рис. 3.9 и 3.10.
Ряд термодинамических параметров был получен из экспериментальных изотерм
связывания. Член (х^2)-1 был определен исходя из концентрации свободного
олигомера в точке перегиба изотермы связывания, а член (4у2]/о)-1 -
исходя из тангенса угла наклона изотермы связывания в этой точке. Такие
приемы оправданны, если <j<g. 1. Для а было найдено значение 0,017.
В данных экспериментальных условиях комплекс полиуридиловой кислоты с
олигоадениловой кислотой в растворе находится в виде свитой тройной
Предыдущая << 1 .. 14 15 16 17 18 19 < 20 > 21 22 23 24 25 26 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed