Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
нанесении [Е] в логарифмическом масштабе получается сигмоидная кривая
связывания. Были сделаны следующие допущения: 1) лиганд в геле ведет себя
как соответствующая свободная молекула в растворе; в действительности же
иммобилизация аффинного лиганда приводит к потере по крайней мере одной
степени свободы в трансляционной энтропии; 2) концентрация лиганда в геле
[L] полагается весьма близкой концентрации, измеренной в единице объема
геля; 3) фермент свободно взаимодействует со всеми доступными лигандами,
в то время как недоступные лиганды не влияют на связывающую способность
фермента; 4) нерастворимый носитель не влияет на связь фермент - лиганд,
кроме создания пространственных затруднений для доступности некоторых
лигандов.
Из рис. 5.3, б видно, что количество связанного трипсина, определенное
экспериментально в ходе исследования равновесного связывания, зависит от
концентрации исходного раствора трипсина (в 0,05 М бицине, pH 8,15, и
0,25 М хлориде калия, 4 ч, 4°С), а также что только аффинный сорбент,
приготовленный из 4%-ного геля агарозы, содержащего 19,2 мкэкв./мл л-
аминобензамидина, характеризуется идеальным поведением. Этот носитель
имеет существенно более высокую емкость при насыщении, чем аффинный
сорбент, приготовленный из 6%-ной агарозы, содержащей
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
67
22,9 мкэкв./мл м-аминобензамидина; при высоких концентрациях трипсина он
близок к 6%-ному гелю, содержащему 48,9 мкэкв./мл ж-аминобензамидина. На
рис. 5.3,6 показана также емкость при насыщении для геля с высоким
содержанием лиганда (L0 = = 48,9 мкэкв./мл), разбавленного равным объемом
немодифици-рованной 6%-ной агарозы. Образующаяся концентрация лиганда
Рис. 5.3. Сопоставление идеального графика связывания фермента (а) и
связывания трипсина на различных гелях (б) [24].
в геле равна, таким образом, Lo=24,45 мкэкв./мл. Однако кривая связывания
существенно ниже, чем для 6%-ного геля с 10= - 22,9 мкэкв./мл. Аффинные
свойства сорбентов, разбавленных немодифицированными гелями, рассмотрены
в разд. 5.3.
Конечно, встречаются случаи, когда пористость геля никак не влияет на
взаимодействие макромолекул с иммобилизованным аф-финантом; это системы с
высоким сродством или с предельно крупными макромолекулами, когда только
аффинные лиганды, иммобилизованные на поверхности гранул носителя,
принимают
5*
68
Глава 5
участие в комплексообразовании. Примером является аффинная хроматография
полисом, рибосом, интактных клеток, органелл или
мембранных фракций. В этих случаях вряд ли можно ожидать, что
хроматографируемые частицы смогут проникать в поры гранул носителя.
Однако для достижения хорошей доступности иммобилизованных аффинных
лигандов и связывающих центров биологических макромолекул даже высокая
пористость нерастворимого носителя не достаточна. Химические группы
аффинанта, принимающие участие во взаимодействии с макромолекулярным
веществом, также должны быть достаточно удалены от поверхности
нерастворимой матрицы, чтобы не возникало стерических затруднений.
Важность пространственного удаления низкомолекулярного ингибитора от
поверхности жесткой матрицы для осуществления аффинной хроматографии
показана Куатреказасом и др. [5] в одной из первых работ по успешному
применению этого метода при выделении ферментов. На рис. 5.4 сопоставлены
результаты аффинной хроматографии а-химотрипсина на сефарозе со связанным
метиловым эфиром е-аминокапронил-о-триптофана (а) и на сефарозе со
связанным метиловым эфиром о-триптофана (б) с данными, полученными на
незамещенной сефарозе (в). В первом случае (рис. 5.4, а) связанный
ингибитор имеет высокое сродство к а-химотрипсину и фермент можно
освободить из комплекса, только если понизить pH элюирующего буфера. При
использовании 0,1 М уксусной кислоты {pH 3,0) фракция химотрипсина
элюируется в виде острого пика и объем элюируемого химотрипсина не
зависит от объема образца, нанесенного на колонку. Во втором случае (рис.
5.4,6), ингибитор, присоединенный непосредственно к сефарозе, имеет
значительно более низкое сродство к выделяемому а-химотрипсину из-за
стерических препятствий, поэтому для элюирования фермента не надо
заменять буферный раствор, и, как можно видеть из рисунка, фермент
элюируется в значительно большем объеме сразу после неактивного
материала. Для подтверждения отсутствия в данных экспериментальных
условиях неспецифической сорбции на носителе была проведена хроматография
а-химотрипсина на незамещенном носителе (рис. 5.4, а).
Однако обнаружено, что хроматография химотрипсина на незамещенной
сефарозе не дает достаточных доказательств отсутствия неспецифической
сорбции. Напротив, Хофсти [12] показал, что сефароза с иммобилизованным
метиловым эфиром е-амино-капронил-о-триптофаном сорбирует, например,
сывороточный альбумин или у-глобулин полностью неспецифически.
Так, для ряда веществ было найдено, что и ферменты, и такие вещества, как
иммуноглобулин, сывороточный альбумин и яичный альбумин, имеют
