Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
10-7-10-5 моль/л. Когда концентрация связанного белка равна концентрации
белок-пептидного комплекса, взаимодействие может быть описано
соотношением
!_________________________=________________________I_х
[Связанный S-белок) [Свободный S-белок]
X *' 1 '
[Весь S-пептид] 1 [Весь S-пептид] '
Концентрационная зависимость [Связанный S-белок]-1 от [Свободный S-белок]
(рис. 4.5) линейна. Отрезки, отсекаемые на абсциссе и ординате, дают
соответственно КЕ1 и [Весь S-nen-тид]-1. Конечно, это соотношение
справедливо только для систем, для которых имеется уверенность, что нет
никакой неспецифической сорбции исследуемого белка.
Сравнивая связывание различных дегидрогеназ и киназ на №-(6-аминогексил)-
5л-АМР-сефарозе и Р'^б-аминогексил)-?2-(5'-аденозин) пирофосфат-сефарозе,
Харвей и др. [9] выразили силу взаимодействия между ферментом и
иммобилизованным нуклеотидом с помощью так называемой "связываемости" р.
Этот параметр представляет собой концентрацию хлорида калия (мМоль/л) в
центре пика фермента при элюировании фермент . линейным градиентом
концентрации КС1 (рис. 4.6 и табл. 4.2) Для определения константы
диссоциации комплекса лактатдеги. i рогеназы с №-(6-аминогексил)-5'-АМР,
связанным с сефарозон Лоу и др. [11] использовали линейную зависимость
между коли чеством связанного фермента и концентрацией иммобилизованного
нуклеотида.
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообраэования 59
О 0,5 1,0 Zfi
[Свободный S-бевок) ' л^моль Рис. 4.5. Типичные графики, получаемые прк
изучении связывании прямым титрованием S-пептнд-агарозы S-белком при pH
7,5 [8].
Рис. 4.6. Хроматография сырого экстракта дрожжей на №-(6-аминогексил)-5'*
АМР-сефарозе [4].
Образец (100 мк-л) сырого экстракта дрожжей наносился на колонку (50X5
мм), содержащую 0,5 г Ме-(б-аминогексил)-5'-АМР-сефарозу, предварительно
уравновешенную to мМ (КНгРО^+КОН); pH 7,5. После отмывки
неадсорбированных белков ферменты элюировались в линейном градиенте
концентрации (0-J моль/л) К.С1 (общий объем элюата 20 мл); скорость
потока 8 чл/ч, В элюате обнаружены: / - инертный белок; 2 " глюкоэа-б-
фосфатде* гндрогеназа; 3 - глутатионредуктаза; 4 - малатдегидрогеназа н 5
^дрожжевая алкоголь-
дегидрогеназа.
Для изучения взаимодействий пептидов с нуклеотидами была использована
хроматография пептидов на поливиниловом спирте, замещенном
олигодезокситимидиловой кислотой и необратимо связанном с ДЭАЭ-целлюлозой
ионными связями [14]. Для этого типа хроматографии был введен термин
"матричная хроматография". Количественная мера пептид-нуклеотидного
взаимодействия возрастает с задержкой пептида на олигонуклеотид - ДЭАЭ-
цел-
60
Глава 4
Таблица 4.2
Сравнение связывающей способности различных ферментов М6-(5-аминогексил)-
5'-АМР-сефарозой(1) и Р'Дб-аминогексил)-Рг-{5'-аденозин)пирофосфат-
сефарозой(П)
Фермент Связыкасмость 0 а
Источник I 11
кодовый номер название I
КФ 1.1.1.27 Лактатдш цдрогеназа Сердце свиньи >1000* >1000п
Мышца кролика >10006 >1000е
КФ 1.1.1.49 Глюкозо-6-фосфат- Дрожжи 0 170
дегидрогеназа 65 490
КФ 1.1.1.37 Малатдегидрогеназа Сердце свиньи
КФ 1.1.1.1 Алкогольдегидроге- Дрожжи 400 0
иаза 0 >10006
КФ 1.2.1.12 и-Глицеральдегид- 3-фосфатдегидро- Мышца кролика
геназа 260
КФ 2.7.2,3 3-Ф осфогл нцера тк и- Дрожжи 70
наза 110
КФ 2.7.1.40 Пирунаткиназа Мышца кролика 100
КФ 2.7.1.1 Гексокииаза Дрожжи 0 0
КФ 2.7.3.2 Креатникцназа Мышца кролика 0 0
КФ 2.7,4.3 Миокиназа То же 0 380
КФ 2.7.1.30 Глииерокиназа Candida mycoderma 122 0
л Свяэываемость [1 отражает меру силы взаимодействия фермента с
иммобилизовании • нуклеотидом и соответствует концентрации (ммоль/л) КС1
в центре пика фермента при элкл ровэнни фермента линейным градиентом
концентрации КС1. На колонку (50X5 мм), соде! жащ>ю i г аффинного
сорбента, наносили 5 Е фермента, 1 - 1,5 мкмоль мл AMP, I[ - 6,0
мкмоль/мл АМР.
^ Для элюирования вводили 200 мкл 5 мМ NADH.
люлозе по сравнению с движением пептида при хроматографш на
мемодифицированной ДЭАЭ-целлюлозе. Для того чтобы исклю чпть возможное
влияние параметров различных колонок, Шот и др. [14] выразили все объемы
элюирования относительно объ< ма элюирования аланина, для которого не
обнаружено заметно задержки па этих колонках. Отношение относительных
объемо элюирования (1Л-), таким образом, равно отношению объемов
элюирования исследуемого пептида УНЭбл и аланина (Vr =
= Унабл/Ули) ¦ Следовательно, взаимодействие пептид - олигонуклеотид
оценивается по разности относительных объемов элюирования (AW) при
хроматографии на двух колонках.
Определение констант диссоциации бинарных комплексов дегидрогеназ с NADH
по концентрациям NADH, необходимых дли элюирования, уже рассматривалось в
гл. 2 (рис. 2.3).
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 61
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Andrews P., Kitchen В. Winzor D. J" Biochem. J., 135, 897-900
(1973).
2. Brinkworth R. !., Masters C. J., Winzor D. J., Biochem. J.,
