Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
/ - специфическая адсорбция; 2 - неспе* цнфическая; 3- суммарная.
()4
Глава 5
Если Ли(II) отличается от /С, более чем в 50-100 раз, разделения можно
достигнуть, например, при раздельном элюировании или при одноразовом
процессе на нерастворимом аффинанте, количество которого точно
соответствует содержанию наиболее сильно связываемого фермента, или при
хроматографии, в которой равновесие между [Е(П)-1] и [Е(I) -1]
достигается очень медленно.
Различия между AGj и A(?l обусловлены изменением стериче-ской доступности
аффинного лиганда после его иммобилизации, его модификацией при
связывании с носителем, природой нерастворимой матрицы и т. п.
5.1. СТЕРИЧЕСКАЯ ДОСТУПНОСТЬ
Основное требование для успешной аффинной хроматографии состоит в том,
что образование комплекса макромолекулярного вещества с аффинантом,
ковалентно связанным с нерастворимым носителем, адекватно образованию их
комплекса в растворе. Это требует прежде всего достаточного пространства,
в особенности если речь идет о взаимодействиях высокомолекулярных
веществ. Отсюда одним из наиболее важных требований, предъявляемых к
нерастворимым носителям, является высокая пористость. В качестве примера
можно рассмотреть сорбцию fi-галактозидазы на сорбентах, приготовленных
путем иммобилизации ингибитора п-аминофепил-р-о-тиогалактопиранозида
через углеводородную "ножку" к полидекстрановому гелю-сефарозе и к
полиакриламидному гелю - биогелю Р-300 [31]. Содержание связанного
ингибитора было почти одинаковым в обоих случаях, однако выделение р-
галактозидазы аффинной хроматографией оказалось успешным только на
сефарозе. Несмотря на высокую концентрацию ингибитора (50 мкмоль/мл),
фермент не задерживался на биоголс Р-300, что, возможно, обусловлено
чрезмерно объемистым тет; мером р-галактозидазы (молекулярная масса 540
000 [3]), кс рый не входил в поры биогеля. Напротив, при выделении нукле.
из стафилококков с молекулярной массой 17 000 [4] биогель Р-оказался
подходящим носителем. Высокая степень пористости растворимого носителя
необходима также при выделении веще с относительно слабым сродством к
иммобилизованному аффиг ту (константа диссоциации ^1(ES моль/л).
Концентрация свя:: ного аффинанта, который легко доступен для выделяемого
во ства, должна быть в этом случае очень высока для достижс сильного
взаимодействия, которое смогло бы физически удерж выделяемые вещества,
движущиеся через колонку,
Влияние пористости геля на доступность нммобил аффинного лиганда,
необходимую для ком комплементарной макромолекулой, показаш Дин [18]
изучили влияние степени пористост
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
65
на связывание иммобилизованным NAD+ лактатдегидрогеиазы и
малатдегидрогеназы в смеси с сывороточным альбумином. На колонке,
содержащей сильно сшитый сефадекс G-25 со связанным NAD+, обе
дегидрогеназы и сывороточный альбумин появляются в
Рис. 5.2. Аффинная гель-фильтрация синтетических смесей (объем образца 50
мкл) бычьего сывороточного альбумина (0,8 мг) с лактатдегидрогеназой
(1,85 Е) (а) и малатдегндрогеназой (0,335 Е) (б) [18].
Колонки (20X5 мм) с NAD+-сефадексом, имеющим различную пористость,
уравновешивались 10 м.Ч фосфатным буфером (pH 7,5); неадсорбируемый белок
отмывался тем же буферным раствором; элюирование осуществлялось в
градиенте концентрации (0-0,5 моль/л) КС1 в том же буферном растворе
(общий объем элюата 20 мл); / -Л2Яо бычьего сывороточного альбумина; 2 -
активность лактатдегидрогеиазы; $ - активность малатдегидро-
генззы.
удерживаемом объеме, поскольку иммобилизованный лиганд недоступен
ферментам, В системе NAD+ -сефадекс G-100 сорбируется малатдегидрогеназа,
в то время как большая часть более высокомолекулярной лактатдегидрогеназы
проходит через колонку вместе с сывороточным альбумином. Обе
дегидрогеназы сорбируются на NAD+ - сефадексе G-200. Взаимодействие
фермента с иммобилизованным NAD+ усиливается с увеличением пористости
5-6
66
Глава 5
геля, как это следует из концентрации хлорида калия, необходимой для
элюирования ферментов, при использовании линейного градиента концентраций
хлорида калия. Исключение дегидрогеназ из аффинных сорбентов,
приготовленных из гелей с различным размером пор, использовано Лоу и
Дином [18] в качестве микрометода для быстрого определения кажущихся
молекулярных масс (метод известен как аффинная гель-фильтрация).
Другим примером существенного влияния пористости геля на емкость
аффинного сорбента является зависимость количества сорбированного
трипсина на 6 и 4%-ной агарозе, модифицированной jw-аминобензамидином, от
концентрации трипсина [24], Пред-
|-N-CHj-CH2-CH2-CH2-CH2-CO-NH-[^Lc^^
полагая умеренные константы связывания, Нишикава и др. [24] рассмотрели с
точки зрения адсорбционной теории гипотетическую систему, для которой на
график наносили концентрацию образующегося комплекса фермент - лиганд
[EL] в зависимости от концентрации фермента в сорбционном растворе [Е]
для трех фиксированных концентраций лиганда [L0] (рис. 5.3,а). При
