Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Туркова Я. -> "Аффинная хроматография" -> 18

Аффинная хроматография - Туркова Я.

Туркова Я. Аффинная хроматография — М.: Мир, 1980. — 472 c.
Скачать (прямая ссылка): afinnayahromatografiya 1980.djvu
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 198 >> Следующая

24% молекул нерастворимого лиганда способны связывать нук-леазу.
Константы Kl, полученные независимо при элюировании ше-стыо различными
аффинными лигандами, имели значения от 0,6-10-6 до 2,6*10_6 моль/л.
Отклонения Kl, по-видимому, не зависят от природы заместителей, связанных
с тимидином. Совпадение значений Kl (в пределах экспериментальной ошибки)
показывает, что на взаимодействие между нуклеазой и аффинной матрицей не
оказывает влияние присутствие другого лиганда. В отличие от Kl константа
Ki сильно зависит от заместителей лиганда. Вероятно, идентичность
значений Ki для pdTp и pdTpAP указывает на то, что аминофенильная группа
пространственной "ножки" не влияет на взаимодействие нуклеазы с
иммобилизованным нуклеотидом. Подобным образом из сопоставления Ki (2,3-
10"6 моль/л) и Kl (1,1 -10-6 моль/л) для pdTpAP следует, что привязка
нуклеотида к нерастворимому носителю не влияет на взаимодействие нуклеазы
с pdTpAP, т. е. взаимодействие нуклеазы с лигандом в растворе и с
иммобилизованным лигандом на нерастворимом носителе обусловлено одними и
теми же силами. Следовательно, этот метод служит не только для
определения констант диссоциации, но также и для оценки влияния
иммобилизации на комплексообразование.
Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12]
высказали возражения. Данн и Чейкеп [7] ограничились случаями, когда
[E]//(l мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента.
Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь,
Например, если константа связывания равна 10~9 моль/л, то рассчитанная
константа скорости диссоциации комплекса EL должна быть очень мала (--
0,042 с-1) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от
кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта.
Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать
влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация-мономолекулярпый
процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда
неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов
буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях
белковый пик настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод
пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие
лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью
обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта.
Для более полного объяснения кривых элюирования ферментов растворами
высокомолекулярных ингибиторов Туркова и др. [15] определили константы
диссоциации комплекса химотрипсина с антилизином по методу Данна и
Чейкена [7]. Антилизин - поли-
4-6
50
Глава 4
валентный ингибитор протеаз, выделяемый из легких (фирма Leciva, Прага,
Чехословакия). По своим свойствам аптилизин очень близок панкреатическому
ингибитору трипсина. Сорбция хи-мотрипсина на N-белзилоксикарбонилглицил-
d-фенилаланин -
Рис. 4.3. Аффинная хроматография химотрипсина на N-бензилоксикарбонилгли-
иил-О-фенилаланил-МН2-сфероне 300 (52X11 мм).
а - элюирование растворами С различными концентрациями (моль/л)
антилизина в 0-05 М HCl-трис-буферноч растворе (pH 8.0, 25°С); 1 -
2,64*10-*; 2 - 1,28-10-*; 3 - 0,66*Ю-*;
4-0,33-10-*; 5 - 0.13-10-? - 0.0710-*. На колонку, предварительно
уравновешенную растворами с соответствующими концентрациями антнлиэнна.
наносилось 3,0 мг химотрипсина. Активность десорбируемого химотрипсина
измерялась на регистрирующем спектрофотометре "Оптои* (Opton); в качестве
субстрата использовался л-нитрофениловый эфир N бенэокси-
карбоннл-Ь-ткрозина 6 - зависимость lf{V-Vo\ от молярной концентрации
антилизика.
-ЫН2-сферопе проводилась в оптимальных условиях, взятых из данных,
приведенных на рис. 3.1. Для элюирования использовались растворы
антилизина в различных концентрациях. Концентрация иммобилизованного
аффинного лиганда [L], определенная исходя из эффективной емкости
колонки, составила 2,6 ¦ 10-5 моль/л. Свободный объем Vm, найденный с
помощью декстрана 2000, равен 2,1 мл, Константа диссоциации комплекса
химотрипсина с
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 51
иммобилизованным ингибитором Kl равна 4,5-10"6 моль/л, а константа
диссоциации комплекса химотрипсина с антилизином КI - 8,8-10~6 моль/л
(рис. 4.3, а и б). Кроме того, проводилась аффинная хроматография
химотрипсина на сфероне со связанным антилизином. После нахождения
свободного объема (Кт = 4,0 мл) и концентрации иммобилизованного
аффинанта ([L] = 1,8-10-5 моль/л) рассчитывались константы диссоциации
комплекса химотрипсина со связанным антилизином Kl = 9,0-10-6 моль/л и с
растворимым антилизином Ki = 8,9-10-6 моль/л. Поскольку значения Кь и К\
очень близки, то можно сделать вывод, что на образование комплекса
химотрипсина с антилизином не оказывает влияния ковалентная привязка
последнего к сферону. Константы диссоциации комплекса химотрипсина с
антилизином, как с растворимым, так и со связанным с матрицей, хорошо
Предыдущая << 1 .. 12 13 14 15 16 17 < 18 > 19 20 21 22 23 24 .. 198 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed